SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量
[原理]
十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實驗基礎上發展起來的一項新技術。用這種方法測定蛋白質的分子量具有快速靈便，設備簡單等優點。
蛋白質的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大多數蛋白質，主要取決于它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無關。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質氫鍵和疏水鍵，并按比例地結合到這些蛋白質分子上形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，每克蛋白質一般結合1.4克SDS。SDS與蛋白質的定比結合使蛋白質-SDS復合物均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過蛋白質原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質間原有的電荷差異。在水溶液中，蛋白質-SDS復合物具有相同的構象，近似雪茄煙形的長橢園棒（短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化），克服了蛋白質間原有的形狀差異。這樣蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質分子量的函數。蛋白質分子量與電泳遷移率間的關系可用下式表示：
lgMr = K – bm
式中 Mr為分子量；K為常數；b為斜率；m為遷移率。
因此，用本法測定蛋白質的分子量只需根據待測蛋白質在已知分子量的標準蛋白質的lgMr～遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。
用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質外，均不是天然蛋白質的完整分子量，而是組成這些蛋白質的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構象異常，或帶有大輔基的蛋白質不適用，如組蛋白F 1 和某些糖蛋白等。對一些結構蛋白如 膠原蛋白 等也不適用。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續系統電泳和 SDS-不連續系統電泳兩類；按照所制成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類。
本實驗采用SDS-不連續垂直板型操作方法。通過實驗使學生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板式電泳的原理及技術，包括制膠、灌膠、加樣、剝膠及固定染色等，學會用這些方法測定蛋白質分子量。
[方法與步驟]
一、加樣液的制備
1、標準蛋白質加樣液的制備 稱取細胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5～1mg，置小 離心管 （Eppendorf管）中，加入樣品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物應離心除去。沸 水浴 熱處理3min，冷卻備用。
2、待測蛋白質加樣液的制備
根據待測蛋白質樣品存在的狀況而定。
（1）固體
待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質固體制劑，加樣液的制備方法同標準蛋白質加樣液的制備；如為含鹽的純蛋白質固體制劑，應先加水充分溶解，對透析緩沖液透析12～16h，然后吸取0.5mL（蛋白濃度應為0.5～1mg/mL），置Eppendorf管中，并加入等體積濃樣品溶解液，沸 水浴 熱處理3min，冷卻備用。
（2）液體
待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質液體制劑，則加入等體積濃樣品溶解液，然后熱處理；如為含鹽的液體制劑，則需先透析。
二、凝膠的制備
1、凝膠板的準備
（1）洗板
將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗玻板，然后用自來水洗凈，再用酒精將板擦干。
（2）安裝制膠板
制膠前將玻板與塑料嵌條和凹型陶瓷板的邊緣對齊，下沿用密封膠帶封口，用塑料夾子或鐵夾子將兩端夾好，注意要確保密封，安放在固定架上。
2、分離膠和濃縮膠溶液的配制
組 分 | 分離膠/mL | 濃縮膠/mL |
凝膠貯備液 | 2.5 | 0.26 |
分離膠緩沖液（pH8.8） | 1.9 | — |
濃縮膠緩沖液（pH6.8） | — | 0.5 |
10%SDS | 0.075 | 0.02 |
TEMED | 0.026 | 0.02 |
雙蒸水 | 3.05 | 1.22 |
10％過硫酸銨 | 0.013 | 0.02 |
總體積 | 7.6 | 2 |
注意：①最后加入10%過硫酸銨溶液，混合制成凝膠液，迅速灌制凝膠。
②丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無毒。
3、制分離膠
將制膠板垂直放好，插上與相應厚度的樣品梳，在梳子下緣線1cm處做標記，卸下樣品梳。將配好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，直至液面達到標記處。用滴管貼近膠液界面小心而又緩慢地覆蓋厚度約0.5cm的正丁醇層，以防止溶液蒸發并保證膠面平整。
4、制濃縮膠
分離膠聚合后，倒去正丁醇，用 蒸餾 水沖洗分離膠膠面兩次，用 濾紙 吸去殘液。用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳。
（三）電泳
1、安裝電泳槽
濃縮膠聚合后，除去梳子、密封膠帶以及六個鐵夾。將制膠扳、電泳糟內芯、另一對制膠板依次放入槽內。兩制膠板的凹型陶瓷板均應與電泳槽內芯接觸。然后插入楔型板以固定兩套制膠板。如果每次電泳只用一塊膠板，必須用提供的有機玻璃板代替另一套制膠板。
2、加樣
在內外水槽加注緩沖液，使內外槽的水位均超過凹形板的缺口但低于塑料板的上沿。用微量加樣器在梳井內加樣。
3、電泳
蓋好上蓋，在80V～100V的電壓下電泳約3h，至溴酚藍指示的電泳前沿到達制膠板的下緣止，關掉電源。然后拔掉楔形板，取下制膠扳。
（四）染色、脫色
用刀片或薄板將白塑料板與陶瓷板輕輕撬開，用刀片沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標記樣品順序。然后手戴橡膠手套將分離膠小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入100mL考馬氏亮藍染液（含0.25%考馬氏亮藍R-250，30％乙醇，10％乙酸的水溶液），加蓋，在 搖床 上染色2h。
將染液倒回貯存瓶（可反復使用）。在染色皿中加入100mL脫色液（10％乙酸，30％乙醇），振蕩脫色至蛋白條帶清晰。
[結果和計算]
1、凝膠脫盡底色后，色帶清晰顯出。按實樣描下或攝下電泳圖譜。
2、根據各蛋白遷移距離和染料遷移距離的比值，求出各蛋白的相對遷移率m r ，然后作出lgMr～m r 關系圖，從圖中找出未知蛋白m r 對應的分子量。
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