微量組織/細(xì)胞 DNA 提取
簡介
從微量樣本中提取 DNA。微量樣本包括：微量血液樣本，如低至 1 μl 全血；微量細(xì)胞樣本，可低至 100 個細(xì)胞，如顯微切割細(xì)胞、流式分選細(xì)胞等；或小于 10 mg 組織，如穿刺樣本、活檢樣本；以及骨骼或化石等疑難樣本。
原理
QIAamp 系列基于 QIAGEN 經(jīng)典的硅膠膜柱技術(shù)，細(xì)胞裂解后釋放出核酸并進(jìn)行蛋白消化，將核酸溶液轉(zhuǎn)移到硅膠膜柱上使 DNA 結(jié)合在柱膜上，經(jīng)洗滌去除雜質(zhì)后洗脫得到 DNA。
材料與儀器
QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)
離心機(jī)
加熱模塊或水浴鍋
1.5 ml 或 2 ml 離心管、無菌吸頭
一次性手套
乙醇（96%–100%）
步驟
提取顯微切割樣本中 DNA 的基本過程可分為如下幾步：
（一）準(zhǔn)備工作與溶液配置
準(zhǔn)備工作：
1、將樣本平衡至室溫（15°C–25°C)；
2、將用于洗提的 Buffer AE 或者蒸餾水平衡至室溫；
3、將 thermomixer 或旋轉(zhuǎn)加熱孵育裝置加熱至 56°C 以備第 3 步使用。如果沒有以上設(shè)備，可以用加熱模塊或者水浴裝置代替；
4、如果 Buffer AL 和 Buffer ATL 有沉淀，可加熱至 70°C 并溫和晃動使其溶解；
5、配置好 Buffers AW1 和 AW2；
溶液配置：
1、AW1：加入 25 ml 乙醇（96%–100%) 至裝有 19 ml Buffer AW1 濃縮液的瓶中。在加過乙醇的瓶子外貼好標(biāo)簽。配好的溶液可以在室溫（15℃–25°C) 下儲存 1 year。
2、AW2：加入 30 ml 乙醇（96%–100%) 至裝有 13 ml Buffer AW2 濃縮液的瓶中。在加過乙醇的瓶子外貼好標(biāo)簽。配好的溶液可以在室溫（15℃–25°C) 下儲存 1 year。
注意：在操作前，須振蕩混勻。
（二）DNA 提取
1、加 15 μl Buffer ATL 至顯微切割樣本中（顯微切割樣本預(yù)先收集在 0.2 ml 的離心管中）；
2、加入 10 μl proteinase K，并間歇渦旋振蕩 15 s 混勻；
3、將 0.2 ml 的微型離心管放在 thermomixer 或旋轉(zhuǎn)加熱孵育裝置上，56°C 孵育 3 h（如果是福爾馬林固定的組織，需要孵育 16 h），期間需要偶爾振蕩。孵育時間視樣本的量可做調(diào)整。
4、加入 25 μl Buffer ATL；
5、加入 50 μl Buffer AL，蓋上蓋子，間歇渦旋振蕩 15 s 充分混勻。為了確保充分裂解，須將樣本同 Buffer AL 充分混勻成均質(zhì)溶液；
6、加入 50 μl 乙醇（96%–100%)，蓋上蓋子，間歇渦旋振蕩 15 s 充分混勻。室溫（15℃–25°C）下孵育 5 min。（注意：如果室溫超過 25°C，先將乙醇在冰上預(yù)冷后加入管內(nèi)）；
7、短暫離心以去除粘在管蓋上的液滴；
8、將離心后的所有液體小心轉(zhuǎn)入 QIAamp MinElute column（柱子裝在一個 2 ml 的收集管里），避免碰到管口邊緣。蓋上蓋子，6000 x g (8000 rpm) 下離心 1 min。將柱子轉(zhuǎn)至一個新的 2 ml 的收集管，將舊的收集管和流出液一起丟棄。如果柱上有殘留，用更高速度離心，直至柱上無殘留。
9、小心打開蓋子，在柱上加入 500 μl Buffer AW1，小心不要碰到管口邊緣。蓋上蓋子，6000 x g (8000 rpm) 下離心 1 min。將柱子轉(zhuǎn)至一個新的 2 ml 的收集管，將舊的收集管和流出液一起丟棄。
10、小心打開蓋子，在柱上加入 500 μl Buffer AW2，小心不要碰到管口邊緣。蓋上蓋子，6000 x g (8000 rpm) 下離心 1 min。將柱子轉(zhuǎn)至一個新的 2 ml 的收集管，將舊的收集管和流出液一起丟棄。須避免柱子接觸到流出液。
11、全速離心（20,000 x g; 14,000 rpm) 3 min，徹底干燥柱膜。這一步是必需的，因為乙醇?xì)埩粲谙刺嵋褐袝绊懙胶罄m(xù)研究。
12、將柱子裝在一個新的 1.5 ml 的離心管（未提供）中，丟棄含有流出液的收集管。小心打開蓋子，加入 20–100 μl Buffer AE 或者蒸餾水于膜的中央。如果高的 pH 值或者 EDTA 含量會影響到下游研究，就用水來洗滌。
注意：確保 Buffer AE 或蒸餾水在室溫（15℃–25°C）下平衡。
13、蓋上蓋子，室溫（15℃–25°C）下孵育 1 min。全速（20,000 x g; 14,000 rpm）離心 1 min。（如果在離心前，室溫下孵育５min，將會有助于提高 DNA 的產(chǎn)量）
注意事項
1、所有離心步驟在室溫下進(jìn)行（15°C–25°C)
2、如果純化 DNA 的樣本細(xì)胞非常少，需要使用 carrier RNA
Carrier RNA 的使用：
1、在 Buffer AL 中加入 Carrier RNA
2、為了從微量樣本中純化 DNA（例如，血樣低于 10 μl），我們建議在 Buffer AL 中加入 carrier RNA 。對于足量的 DNA 樣本，這一操作是非必須的。在裝有 310 μg 凍干 carrier RNA 的管子中加入 310 μl Buffer AE，得到 1 μg/μl 的溶液。充分溶解后，分裝凍存于–20°C 。不要反復(fù)凍融超過 3 次。
3、依照對應(yīng)試劑盒說明，計算每個樣本所需 Buffer AL 和 carrier RNA 的量，乘以處理的樣本數(shù)，即可知道每次使用的 Buffer AL 和 carrier RNA 的量。將吸取誤差考慮在內(nèi)，每次可多計算 2 個樣本的量。
4、正反倒置管子 10 次，溫和混勻 Buffer AL 和 carrier RNA。為了避免產(chǎn)生氣泡，請不要渦旋振蕩。注意，carrier RNA 不是溶解在 Buffer AL 中。必須先溶解在 Buffer AE 里，在使用的時候再加入到 Buffer AL 中。加了 carrier RNA 的 Buffer AL 可在室溫（15°C–25°C) 下穩(wěn)定 48 h 。
