一、二倍體細胞培養法

原理

二倍體細胞來源體內二倍體細胞，也即正常細胞的初代培養。初代培養細胞成功后能始終保持二倍體細胞性狀，便成為二倍體細胞培養。

二倍體細胞雖不難培養，但欲求長期呈旺盛地增殖生長、并保持二倍體細胞性狀，亦非易事。為此必須采取一些有效的措施，一是低溫凍存，二是妥善的培養方法。

用反復傳代的方法以求獲得大量細胞和維持細胞長期生存的辦法是不妥的。因在反復傳代中，難免由于培養條件的變化和其它不利影響，使細胞生物學性狀發生變化。隨時間延長不僅能導致細胞停止生長，并可失掉二倍體性狀或發生轉化。

材料與儀器

細胞
培養液 BSS 胰蛋白酶 消化液
培養瓶

步驟

二倍體細胞培養方法與一般培養相同，關鍵在于傳代，其傳代程序為

1.  吸除舊培養液注入另瓶中；

2.  用BSS沖洗1 次；

3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋住細胞層即可；作用1~5 分鐘；

4.  待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；為防止細胞丟失可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養液（新舊培養液按2：1）新舊混合；

5.  輕輕反復吹打制成單個細胞懸液（消化不足或吹打不充分，易形成細胞團，不利于生長，應注意避免）；

6.  按一分為二比例接種培養。

常見問題

一、要點

1.  采取以下措施可能利于二倍體細胞培養

（1）嚴格控制pH值，最好在5 %CO2溫箱中培養；

（2）換液時間不要間隔太長，且不要全部更新，盡量保留一部分舊培養液，以棄掉1/2或2/3為妥；

（3）傳代期不能過長，不能讓細胞長得過于密集，一旦細胞接近或剛剛連接成片，即進行傳代；

（4）要選用高質量的培養基和血清，并盡量維持不變，每次傳代都按一分為二的原則（細胞數量、營養液量、培養瓶的空間和面積都不得一樣）進行培養；

（5）傳代后如細胞不用于實驗，立即低溫凍存。

2.  來源于胚胎的二倍體成纖維細胞平均分裂 50 次左右即進入衰退期。

不同種類和來源的二倍體細胞生存期都不一樣，但生存期皆有限。

雖然二倍體細胞具有限的生存期，卻完全能滿足反復使用的要求。

以成纖維細胞為例，即便從初代接種1 個細胞算起，按產生的細胞數=n×2n（n=接種細胞數）計算，它所提供的細胞也近天文數字。而在實際應用上，初代接種的細胞都幾十萬以上，因此一個二倍體細胞系最終提供的細胞數量近于無限的。

二、討論
如何能保留有大量可利用的二倍體細胞？首先在初代二倍體細胞培養時，要接種多量細胞；生長成功后立即凍存做為種細胞（ Stock）。用于實驗時，解凍1 分Stock，傳1~3 代，按下式處理：

據上，可見二倍體細胞是可長期應用的。