增殖型腺病毒系統
增殖型腺病毒系統又稱為腫瘤特異性增殖型腺病毒，多用于腫瘤的基因治療。該載體利用腫瘤與正常組織及細胞間結構或代謝途徑上的差異，使病毒可以特異性地靶向腫瘤細胞內復制、增殖，大量表達目的基因并最終裂解腫瘤細胞。以增殖型腺病毒載體作為腫瘤生物治療的平臺，可以充分利用腺病毒體積較小、彌散能力強的特點，與傳統的復制缺陷型腺病毒載體比較有以下幾個優點：病毒的大量增殖可以直接殺死感染的腫瘤細胞，并擴散到鄰近腫瘤細胞；腺病毒溶解腫瘤細胞能釋放腫瘤抗原，提呈給樹突狀細胞和 T 細胞識別，起到 " 瘤苗 " 的作用，產生抗腫瘤免疫反應；除了自身的溶腫瘤能力，增殖型腺病毒載體在大量復制增殖的同時還可使所攜帶的外源基因大量表達，通過多種途徑殺滅腫瘤。與傳統的腫瘤基因治療以及化療方案不同，以增殖型腺病毒載體攜帶抗癌基因治療腫瘤過程中所表達的抗癌活性物質不但不會因藥物半衰期而減少，從理論上講，只要腫瘤細胞存在，抗癌活性物質就會表達，直至殺滅全部的腫瘤細胞。對于增殖型腺病毒載體來說，最重要的莫過于安全性的問題，也就是如何使其識別何者為腫瘤細胞，何者為正常細胞，換言之，就是靶向性的問題。大體上，增殖型腺病毒載體的靶向性是通過以下三種策略實現的：
1) 基因缺失突變
我們知道，細胞被病毒感染后的許多表現與細胞在發生癌變時出現的變化極其相似（如， p53 腫瘤抑制蛋白的失活等）。這就使利用基因敲除的方法使病毒在腫瘤細胞內有選擇性地復制增殖成為可能。目前在這方面的研究可以分為兩個發展方向：大段的基因敲除和有選擇性地敲除腺病毒有效復制所必須且（或者）對正常細胞有毒性但在腫瘤細胞中卻不需要的基因。前者中比較有代表性的是 E1B-55kD 區敲除的 ONYX-015 （又名 dl 1520 ， CI1042 ）。 Bischoff JR 教授認為：腺病毒在其生活周期中早期表達的蛋白 E1A 可以激活宿主細胞的 p53 途徑使細胞凋亡， E1B-55KDa 蛋白可以阻斷該途徑，使腺病毒在宿主細胞內完成完整的生活周期。因此， E1B-55kDa 缺失的腺病毒感染 p53 功能正常的細胞后，其 E1A 激活宿主細胞的 p53 途徑，該細胞將發生凋亡，病毒不能有效復制。而在 p53 功能異常的細胞（ 50% 左右腫瘤細胞的 p53 功能異常）內則可以復制增殖并最終將其裂解。雖然， ONYX-015 溶瘤的確切機制還有待于進一步的商榷，但在已結束的 II 期臨床試驗中，用 ONYX-015 聯合常規化療治療頭頸部腫瘤，顯示出良好的抗腫瘤能力（總有效率 63% ，為迄今最有效的腫瘤生物治療的臨床報告之一）。與 dl 1520 這種大段的基因敲除不同，增殖型腺病毒Δ 24 及 dl 922-947 作為有選擇性的基因敲除的代表，缺失的是腺病毒基因組中單一的保守區 E1A CR2(E1A conserved region 2) ，而對于其他有功能的部分并未觸及，因此這兩種病毒具有更好的靶向性，即 pRb 功能異常的細胞系（與 p53 途徑一樣，大多數的人類腫瘤細胞有 pRb 功能丟失的現象）；如果將野生型的 pRb 轉導到 Rb- 的腫瘤細胞株內，則Δ 24 和 dl 922-947 復制明顯受到抑制。無論是在體內還是在體外實驗中， dl 922-947 的殺傷能力都明顯強于 dl 1520 。在人類腫瘤的裸鼠移植模型上，經靜脈途徑給予 dl 922-947 更是獲得了甚至超過野生型腺病毒的治療效果。
2) 利用組織 / 腫瘤特異性啟動子調控病毒的復制
許多腫瘤組織特異性啟動子已被人類所認識，可將其分為三類：①針對所有腫瘤特征的啟動子，如缺氧啟動子、端粒酶啟動子等；②針對個別腫瘤特征的啟動子，如肝癌的甲胎蛋白（ AFP ）啟動子、胃腸道腫瘤的癌胚抗原 (CEA) 啟動子以及乳腺癌和卵巢癌的 DF3/MUC-1 啟動子等；③針對某一類組織（必需不是至關重要的組織）特征的啟動子，如前列腺特異性抗原（ PSA ）啟動子等。將組織 / 腫瘤特異性啟動子插入到病毒增殖必需基因的上游，可以在轉錄水平對病毒復制進行調控，使病毒靶向特定的組織。這一類病毒又被稱為臨時性增殖型病毒（ provisionally replicating virus ）近年來，對這方面的研究發展很快，幾乎涉及到迄今發現的每種啟動子。但研究發現，不同的啟動子之間在特異性和對腫瘤 / 組織及病毒基因的調控活力方面參差不齊，因此在選擇時應當慎重。比如 AFP 啟動子和 DF3/MUC-1 啟動子調控的臨時性增殖型腺病毒分別被用于對肝細胞癌和表達 MUC-1 的乳腺癌的研究，均表現出很強的抗腫瘤活性，相反用 E2F 啟動子 / 增強子對 E1A 進行調控卻表現除出多種細胞和組織的靶向作用。應用這一策略最成功的例子來自美國的 Calydon 制藥公司的 CN 706 。 1997 年， Rodriguez R 等人將人類 PSA 基因的啟動子 / 增強子成功插入到 5 型腺病毒 E1A 區的上游，并將其命名為 CN706 ，這種通過 PSA 啟動子 / 增強子調控的臨時性增殖性腺病毒，在 LNCaP （一種經修飾的可產生 PSA 的細胞株）內可以復制增殖，并高水平地表達 E1A ，而在 DU145 （不產生 PSA 的人前列腺細胞株）內不增殖。對裸鼠移植瘤模型進行一次 CN706 瘤內注射后即不再有 PSA 產生。目前該病毒已進入對局部復發的前列腺癌患者的 I 期臨床試驗。這種策略中有一個較大的弱點，即真核細胞的啟動子并不能在病毒的基因組中嚴格地控制轉錄，而只需有少量的病毒產物（如， E1A ）就足以滿足病毒增殖的需要，這就無法達到特異性的目的。研究表明，將啟動子與病毒的基因組 DNA 隔絕開來是解決這個問題的一個好方法。有人嘗試將經過改造的帶有特異性啟動子的病毒基因調控盒子裝入一個質粒載體中與轉入細胞內，因為該載體只表達一次，病毒也就只能進行一輪復制。另外，用組織特異性啟動子對兩個（或更多）病毒復制必需基因進行調控，也是一種有效途徑。比如， CN706 第二代產品 CV787 ，就是用兩個 PSA 啟動子 / 增強子分別控制腺病毒的 E1A 和 E1B 區，具有比 CN706 更好的靶向功能，目前也已經進入 I 期臨床試驗。
3) 對病毒外殼蛋白進行改造
腺病毒的感染過程包括三個貫序發生卻又截然分開的過程，即粘附、內化和入核。任何一種成功的提高腺病毒載體靶向性的改造都應以不影響腺病毒的這三個過程為原則。腺病毒的粘附和內化過程分別與細胞表面的柯薩奇 - 腺病毒受體（ CAR ）和腺病毒五鄰體表面的 RGD 小肽（精氨酸 - 甘氨酸 - 天門冬氨酸）有關。前者與腺病毒纖維蛋白的頭部結合介導粘附過程，后者與細胞的整合素受體相互作用介導內化。基于以上的認識，人們設想通過對腺病毒外殼蛋白改造以提高其靶向性，這個過程又稱為重新定靶（ retargeting ）。主要有以下幾種方法：
① 應用雙特異性抗體 該方案的思路是：構建一個雙特異性抗體，其一端是針對腺病毒頭部的單克隆抗體，另一端是一個可以與所靶向的腫瘤細胞表面的特異性受體結合的配體。 FGF2 （成纖維細胞生長因子）受體在包括膠質瘤、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞的表面有過度表達，因此構建兩端分別為抗腺病毒頭部單抗和 FGF2 的雙特異性抗體可以使腺病毒靶向這些腫瘤細胞。這種治療方案目前被用于對 Kaposi 肉瘤和卵巢癌的治療，并正在進行 I 期臨床試驗。同樣的方法也適用于在膠質瘤等多種腫瘤細胞表面高水平表達的 EGFR （表皮生長因子受體）。 Watkins 等人構建了一種 EGF 與抗腺病毒纖維結構但鏈抗體的融合蛋白用于膠質瘤的治療。這種方法的不足之處在于：由于抗腺病毒頭部的單抗與頭部之間是通過非共價連接，靜脈給藥時很容易脫離。
② 對腺病毒纖維結構（或五鄰體亞單位）的修飾 這種方法是對上一方法的改良，其策略是對腺病毒的纖維結構直接進行修飾，使其可以與腫瘤細胞表面的特異性受體結合。但進行這種改造時需要注意兩點問題：首先，腺病毒的纖維結構是以三聚體的形式存在的，任何形式的修飾都應以不影響這種三聚體為原則；其次，經過修飾的纖維蛋白等同于配體，它應該能夠被腫瘤細胞表面的特異性受體識別并與之結合。 Dmitriev 等人將 FLAG 肽插入 HI 環，發現不會影響腺病毒存活和增殖。其后他們將 RGD-4C 肽插入 HI 環，構成腺病毒載體 AdRGD ，該病毒可通過插入肽 RGD-4C 識別特異性受體，使 AdRGD 與靶細胞特異性地相互作用。由此獲得非 CAR 依賴性腺病毒，使許多 CAR 陰性的腫瘤細胞系腺病毒感染率大幅度提高，這些腫瘤包括卵巢癌、胰腺癌、膽管癌、結腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌。
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