離子交換柱層析分離核苷酸
一、目的：
學習離子交換柱層析法分離核苷酸的原理及方法。
二、原理：
離子交換作用一般指在固相和液相之間發生的可逆的離子交換反應，它可用于分離各種可解離的物質。通常離子交換劑是在一種高分子的不溶性母體上引入若干活性基團。這樣人工會成的離子交換劑具有各種各樣的性能。作為不溶性母體的離分子有樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或無機聚合物等，引入的活性基團可以是酸性基團，如強酸型的含有磺酸基（—SO 3 H）、中強酸型的含磷酸基（—PO 3 H 2 ）、亞磷酸基（—PO 2 H）、弱酸型的含有羧基（—COOH）或酚羧基（—OH）等。也可以是堿性基團，如強堿型的含季銨[—N + (CH 3 ) 3 ]、弱堿型的含叔胺[—N(CH 3 ) 2 ]、仲胺（—NHCH 3 ）、伯胺（—NH 2 ）等。
在一定條件下，離子交換樹脂吸附的物質數量和在溶液中的物質數量達到平衡時，兩者數量之比叫分配系數（平衡常數）。理想的情況是洗脫曲線和分配系數相符合，待分離的各種物質的分配系數，應有足夠的差別，以Kd表示分配系數：
式中 M s 和 M l 分別代表單位重量離子交換樹脂和單位體積溶液中溶質的摩爾數。當有A、B兩種溶質進行離子交換柱層析時，吸附在離子交換樹脂上的溶質為高濃度的競爭性離子所交換并被洗脫下來。溶質的遷移速度與分配系數成反比，因此由原點到A、B兩種物質波峰間距離的比值決定于它們分配系數的比值。各波峰的幅度和形狀由柱長及其他因素（如交換樹脂顆粒的大小形狀、交聯度、流速等）所決定。
溶質的分配系數不僅與其電荷有關，也受到它與離子交換樹脂的非極性親和力以及兩者之間的空間關系等因素的影響。
在一定條件下，離子交換樹脂對不同單核苷酸的吸附能力是不同的，因此選擇適當類型的離子交換樹脂，控制吸附及洗脫的條件便可分離各種單核苷酸。
為了增加單核苷酸在離子交換樹脂上的吸附能力，需要：
（1）控制條件，使單核苷酸帶上大量相應的電荷。這主要是通過調節pH值，使單核苷酸的一些可解離基團（磷酸基、氨基、烯醇基）解離，四種單核苷酸相對分配系數與pH的關系如圖14-1。
（2）減少上柱溶液中除單核苷酸外的其它離子的強度。洗脫時則相反：使被吸附的單核苷酸的相應電荷降低；增加洗脫液中競爭性的離子的強度，必要時提高溫度使離子交換樹脂對單核苷酸的非極性吸引作用減弱。
RNA可被堿水解成2＇-或3＇-核苷酸。可利用陽離子交換樹脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，磺酸型）或陰離子交換樹脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，季銨堿型）分離單核苷酸。本實驗利用強堿型陰離子交換樹指（強堿型201×8、強堿型201×7、國產717、Dowex1、Amberlite IRA—400或Zerolit FF等）將各類核苷酸分開，測定核苷酸的紫外吸收光譜的比值：O．D 250 /O．D 260 、O．D 280 /O．D 260 、O．D 290 /O．D 260 對照標準比值（表14-1），可以確定其為何種核苷酸，同時也能算出RNA中核苷酸的相對摩爾比。
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