重組載體的構建及鑒定
引言：根據實驗目的，設計需要重組目的基因或RNAi片段，通過生物合成公司合成，需要說明的是設計的每條單鏈DNA其兩端都應有沒切位點，以便于重組。
1. 合成 的 ssDNA ，分別命名：編碼鏈為 Forward ssDNA , 模板鏈為 Reverse ssDNA ， 每1 OD ssDNA 各加33 μl 無菌去離子水溶解，分別取18 μl 進行退火。
在1.5ml Eppendorf管中依次加入以下試劑
10× PCR buffer 4μl
Forward ssDNA 18μl
Reverse ssDNA 18μl
總體積 40μl
混勻，離心集中樣品。 90 ℃ 5min ,緩慢冷卻至室溫。
2. dsDNA 的雙酶切
dsDNA 的 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ雙酶切
1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下試劑
10×Tango buffe r 10μl
酶1 1 μl
酶2 1 μl
dsDNA 20μl
無菌去離子水 17μl
總體積 50μl
BamH1，Hind Ⅲ 在 2XTANGO中活性比其他幾種BUFFER中要高，因此我們如果要用BamH1，Hind Ⅲ 做雙酶切的話，首選的BUFFER是 TANGO，下面的雙酶切中BUFFER 選擇也是一樣的 ）。
混勻，離心集中樣品。 37 ℃ 溫育過夜，次日，酚氯仿抽提一次， -20 ℃ 無水乙醇沉淀過夜。再次日， 4 ℃ 10000rp m 離心 10min 。 沉淀用 70 ﹪的酒精洗滌一次， 37 ℃ 烘干，加 200μl 無菌去離子水溶解。
3 質粒載體 的雙酶切。
1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下試劑
R buffer 5μl
酶1 1 μl
酶 Ⅱ 1μl
空質粒 5μl
無菌去離子水 38. 5 μl
總體積 50μl
混勻，離心集中樣品。37 ℃ 溫育4h，取10 μl 進行1.0 ﹪ 的瓊脂糖凝膠電泳。
4 pSUPER.basic 雙酶切后大片段凝膠回收
使用BioDev北京博大泰克得 B 型小量 DNA 片段快速膠回收試劑盒，按說明書的步驟回收大片段。
5 雙酶切后的 空載體 與 dsDNA 連接。
連接體系如下：
1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下試劑
T4 Ligase buffer 1 μl
T4 ligase 1 μl
dsDNA 1 μl
空質粒 4 μl
無菌去離子水 3 μl
總體積 10 μl
混勻，離心集中樣品，16 ℃ 連接過夜。
6 連接產物的轉化
5lu雙酶切dsDNA加入到100ul 感受態細胞（JM109），冰浴30min，42 0 熱休克90s，加入400ul無抗的LB ，37 0 ，150rpm，1h，涂平板。37 0
過夜。
7 質粒提取。
8 PCR鑒定。
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