蛋白復性（二）-基因重組蛋白質的體外復性
摘要
基因重組蛋白在大腸桿菌中表達時，由于表達量高，往往形成無生物活性的包涵體。包涵體必須經過變性和復性的過程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質的復性率，是生物工程技術的一個研究熱點。對近年來的重組蛋白質的復性方法做一評述，為研究蛋白質折疊以及復性技術的進一步應用提供依據。
關鍵詞
重組蛋白 包涵體 復性 二硫鍵
到目前為止，人們表達的重組蛋白質已有4000多種，其中用E.coli表達的蛋白質要占90%以上，盡管基因重組技術為大規模生產目標蛋白質提供了嶄新的途徑，然而人們在分離純化時卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質在E.coli中絕大多數是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1~3.0μm的固體顆粒[1]。自從應用大腸桿菌體系表達基因工程產品以來，人們就一直期望得到高活性、高產量的重組蛋白。不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性才能獲得天然結構以及生物活性，因此應該選擇一個合適的復性過程來實現蛋白質的正確折疊，獲得生物活性，近年來的研究可以使復雜的疏水蛋白、多結構域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復性。
包涵體形成的原因
重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體[2]。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。
1、 表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。
2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。
3、 重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。
5、 有報道認為，豐富的培養基有利于活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時，容易形成包涵體。
減少包涵體形成的策略
1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。
2、 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。
3、 供給豐富的培養基，創造最佳培養條件，如供氧、pH等。
包涵體的分離及溶解
對于生物制藥工業來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質的破壞。由于包涵體是蛋白質聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對培養收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解[6、7、8]。
包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業中；酸，如70%甲酸[9]，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2 、Fe3 等金屬離子與還原狀態的巰基發生氧化反應[10]。
蛋白質的折疊機理
包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發的從變性的熱不穩狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物活性的天然結構[11]。然而在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭[1]。對于蛋白質的折疊機制，目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個“熔球態”的中間狀態，在“熔球態”中，蛋白質的二級結構已經基本形成，其空間結構也初具規模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構，總之，蛋白質的具體步驟可用下式描述[12、13、14]：
伸展態→中間體→后期中間體→天然態體→聚集體
在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉變為天然態的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復性過程相互競爭，故而應盡量避免聚集體的產生。一般認為，蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內的疏水相互作用，可促進蛋白質正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復性時間等因素的影響。
提高重組蛋白質折疊復性的方法
一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：活性蛋白質的回收率高；正確復性的產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品；折疊復性方法易于放大；復性過程耗時較少[15]。
1、 透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法是最傳統也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，復性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業放大[16]。
2、 高蛋白濃度下的復性方法：一個成功的復性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續或不連續地加入到復性液中[17]。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略[4]。變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行[18]，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發正確復性。
3、 添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；c、氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率[19]；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩定蛋白的活性狀態、降低非正確折疊的穩定性、增加折疊中間體的穩定性、增加解折疊狀態的穩定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩定另外一種蛋白質的不穩定構象，并能通過有控制的結合和釋放，促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸的一類蛋白質[20]。折疊酶有二硫鍵異構酶、脯氨酸異構酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調節蛋白質的正確折疊，提高蛋白質的合成效率。但這類蛋白在折疊復性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。g、人工伴侶[21]：為模仿分子伴侶而發展的一種方法：首先，變性蛋白被復性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復合體，復合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環糊精從復合體中去除去污劑，使得蛋白質正確折疊。h、單克隆抗體[22]：待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助復性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。I其它：多聚離子化合物如肝素可以促進蛋白質的復性，具有穩定天然蛋白質的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機會，減少錯配以提高復性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團間的斥力，有利于蛋白質的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩定的作用。jklmn
4、 液相色譜（LC）復性法：液相色譜是一種最有效的純化蛋白質的方法，已成為基因重組蛋白質純化的必不可少的手段，現有報道，疏水相互作用色譜（HIC）[23]、離子交換色譜（IEC）[24]、凝膠排阻色譜（SEC）[25]、親和色譜（AFC）[26]已成功的對變性蛋白進行了復性。與傳統的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優點是：在進樣后可很快的除去變性劑；由于色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率；在蛋白質復性的同時，可使目標蛋白質與雜蛋白分離達到純化的目的，使復性和純化同時進行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。4種色譜法，SEC的分離效果是LC中最差的，鹽酸胍會在IEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來，AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴，HIC是其中較為理想的。變性蛋白在HIC上的復性機理為：當蛋白質、變性劑和雜蛋白進入HIC系統后，由于變性劑在柱子上的作用力較弱，變性蛋白質的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白質分離，隨流動相一起流出色譜柱，又因HIC固定相能提供較常法高出十至數百倍的能量*，在變性蛋白質被HIC固定相吸附的同時瞬時除去以水合狀態附著在蛋白質表面和與固定相表面接觸區域的小分子*，而蛋白質的特定的疏水性氨基酸殘基與HIC固定相表面作用以形成區域立體結構，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷地在固定相表面上進行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復性，形成與天然蛋白質構象相同的蛋白質，并流出色譜柱。HIC固定相是從高鹽溶液中吸附變性蛋白質，且與變性劑瞬時分離，不僅大大降低了蛋白質間的聚集作用，還因固定相在分子水平上為變性蛋白提供里很高的能量，使水化的變性蛋白質瞬時失水，并形成局部結構以利于蛋白質從疏水核開始折疊。HIC在蛋白質復性的同時還能與其它雜蛋白進行很好的分離，且HIC柱便宜、快速，故有很好的發展潛力。
5、 反膠束復性法[27]：由于蛋白質在反膠束內水相中可以保持其構象和活性，運用相轉移技術可以將蛋白質分子包于反膠束內，由于這樣可使蛋白質相互分離，減少了蛋白質折疊過程中的聚集作用，通過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質復性，但表面活性劑對蛋白質具有變性作用。
6、 雙水相復性法[15]：Forciniti用硫氰化鈉、氯化鈉、溴化鋰與聚乙二醇構成的雙水相系統使得包涵體的溶解與蛋白質的折疊復性在一步雙水相技術操作中完成。由于PEG具有穩定蛋白質構象的作用、高濃度鹽則具有去穩定的作用，這樣正確折疊的蛋白質會不斷進入到另一相中，直到蛋白質的折疊與去折疊達到一個平衡。
蛋白質知道如何折疊，但我們對蛋白質折疊和聚集的機制尚不十分清楚，每種蛋白質都有自己特有的折疊方式和途徑，因此對某種蛋白質的復性必須反復試驗，利用折疊和聚集的知識建立相對優化、適合生產規模的方法。
參考文獻
[1]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R.Advances in refolding of proteins produced in E.Coli . Curr Opin Biotechnol,1998,9(5):497-501
[2]Gribskov M, Burgess RR. Overexpression and purification of the sigma subunit of E.coil RNA polymerase. Gene,1983,26:109
[3]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E.coli. Curr Opin Biot,1998,9:442
[4]Xie Y, Wetlaufer D B. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic. Protein Sci,1996,5(3):517-523
[5]Georgious G, Valax P.Expression of correctly folded protein in E.Coli. Curr Opin Biotechnol,1996,7(2):190-197
[6]Rudolph R,Bohm G, lilie H, et al. Folding proteins. In:Creighton T E ed. Protein Function: A Practical Approach, 2nd.New York: IRL,1997,57-99
[7]CowleyDT, MackinRB. Expression, purification and charaterization of recombinant human proinsulin. FEBS Lett,1997,402:124
[8]Kuruez I,Titus JA, Jost CA. Correct disulphide pairing and efficient refolding of detergent-solubilized single chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies.Mol Immunol,1995,12:1443
[9]Stockel J, Doring K, Malotka J. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimer classⅡ major histocompatibility complex molecular. Eur J Biochem,1997,248:684
[10]Builder S, Hart R, Lester P,et al. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I. US patent,PN 5 663 304,1997-09-02
[11]Zhao Qin-yi.Irreversible Thermodynamic Theory for Protein Folding and Protein thermodynamic Structures. Prog.Biochem Biophys,2001,28(3):429-435
[13]Kiefhaber T, Rudolph R,Kohler H-H et al. Protein aggregation in vitro and in vivo:a quantitative model of the kinetic competition between folding ang aggregation. Biol Technology,1991,9:825-2-829
[14]Yeh Sih, Rousseau D. Folding intermediates in cytochrome c. Natu Stru Biol,1998,5(3):222
[15]Creighton TE. How important is the molten globule for correct protein folding?Trends Biochem Sci,1997,22:6
[16]Forciniti D. Protein refolding using aqueous two-phase systems.J Chromatography A,1994,668(1):95-100
[17]de Bernardez C E. Refolding of recobinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1998,9(2):157-163
[18]Hevehan D L,Clark E D B.Oxidative renaturation of lysizyme at high concentration. Biotechnol Bioeng,1997,54:221-230
[19]Maeda Y, Ueda T, Imoto T. Effective renaturation of denatured antibody improve its in vivo folding.Protein Eng,1995,8:81-89
[20]Simmons T,Newhous Y M, Arnold K S et al . Human low density lipoprotein receptor fragment successful refolding of a functionally active ligand-binding domain produced in E.coli.J Biol Chem,1997,272(41):25531-25536
[21]Rozema D,Gellman S H. Artificial chaperone-assisted refolding of denatured-reduced lysizyme:modulation of the competition between renaturation and aggregation . Biochemistry,1996,35(49):15760-15771
[22]Sadana A.Protein refolding and inactivation during bioseparation:bioprocessing implications.Biotech Bioeng,1995,48(5):481-489
[23]Geng X,Chang X.J Chromatogr,1992,599:185-194
[24]Suttnar J,Dyr J E,Hamsikova E et al. J Chromatogr B,1994,656(1):123-126
[25] Werner M H,Clore G M,Gronenborn A M et al . FEBS Lett,1994,345(2-3):125-130
[26] Taguchi H,Makino Y,Yoshida M.J Biol Chem,1994,269:8529-8634
[27]Hagen A J,Hatton T A, Wang D I C. Protein refolding in reverse micelles.Biotech Bioeng,1989,35(4):955-965
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