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cDNA第一鏈的合成
發布日期:2022-09-30 08:25:59


cDNA第一鏈的合成


通過體外無細胞系統翻譯找出目的基因mRNA以后,變可進行cDNA第一鏈的合成,其步驟包括:


1)在Ependorf管中加50pmol/L的一種α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl(10μg),100m mol/L甲基氫氧化汞1μl,室溫反應l0分鐘,使RNA變性。


2)加100m mol/L的β-巰基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制劑2μl,室溫放置5分鐘。β-巰基乙醇有穩定逆轉錄酶活性的作用。


3)向上述反應混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12~18聚體)10μl,1mol/L Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol/L KCl7μl,250m mol/L MgCl22μl,再加20 m mol/L的4種dNTP各2.5μl,逆轉錄酶2μl(40單位),用水補充到50μl,充分混勻,42℃反應1~3小時。


4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl終止反應,然后加150m mol/L NaOH 25μl,65℃反應1小時,或37℃8小時,水解mRNA模板,得到cDNA第一鏈,再加pH8.0,1m mol/L Tris.HCl,各25μl中和其pH。


5)測定放射活性,計算合成的DNA量。實際上,cDNA第一鏈的產量往往不會超過poltAmRNA用量的10%~30%。


6)用等體積的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100離心柱層析(參看第6章)將cDNA同剩余的dNTP分開,以2.5倍體積的95%冷乙醇沉淀。


7)合成的cDNA第—鏈在1.4%的堿性瓊脂糖凝膠上電泳,用末端標記的pBR322限制性片段為分子量標準,電泳后,鋪X-光片,進行放射自顯影,確定cDNA第一鏈的大小。



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