DNA的凝膠電泳
實驗原理
DNA電泳是基因工程 中最基本的技術，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩類：
（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳 適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。
（2）瓊脂 糖凝膠電泳 可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.5～0.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。電泳結果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。
瓊脂糖凝膠
瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結構，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。表2-1給出了不同濃度凝膠對DNA片段的線性分離范圍。
表2-1不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍
瓊脂糖/％
標準
高強度
低熔點
低粘度低熔點
0.3
0.5
700bp～25kb
0.8
500bp～15kb
800bp～10kb
800bp～10kb
1.0
250bp～12kb
400bp～8kb
400bp～8kb
1.2
150bp～6kb
300bp～7kb
300bp~7kb
1.5
80bp~4kb
200bp~4kb
200bp~4kb
2.0
100bp~3kb
100bp~3kb
3.0
500bp~1kb
500bp~1kb
4.0
100bp~500bp
6.0
10bp～100bp
由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，象NaClO4能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。
隨著實驗技術的發展，也針對不同用途開發了各種類型的瓊脂糖凝膠：
（1）低熔點瓊脂糖凝膠，用于DNA片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接等；
（2）高熔點凝膠，可分離小于1kb的DNA片段，專用于PCR產物的分析；
（3）快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節省實驗時間；
（4）適用于DNA大片段的分離。
（5）其它類型。各生產商還開發很多類型的凝膠，可根據實驗要求選擇不同類型的，選擇原則是考慮合適的機械強度和熔點。
DNA電泳影響因素
DNA為堿性物質，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負電荷，在一定的電場力作用下向正極泳動。而DNA鏈上的負電荷伴隨著DNA分子量的增加而增加，荷質比是一常數，故電泳中DNA的分離類似分子篩效應。電泳中影響DNA分子泳動的因素很多，主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。
⑴DNA分子大小 DNA分子越大在膠中的摩擦阻力就越大，泳動也越慢，遷移速率與線狀DNA分子質量的對數值成反比。
⑵DNA分子構型 對于質粒DNA分子即使具有相同分子質量，因構型不同也會造成電泳時受到的阻力不同，最終造成泳動速率的不同。常規電泳中質粒DNA分子的3種構型泳動速率：超螺旋最快、線狀分子次之，開環分子最慢。
⑶不同的膠濃度 對于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。不同膠濃度對于DNA片段呈線性關系有所區別，濃度較稀的膠線性范圍較寬，而濃的膠對小分子DNA片段呈現較好的線性關系。所以常規實驗中對于小片段DNA分子的分離采用高濃度的膠分離（有時甚至用2％的凝膠），而對于分離大片段則用低濃度的凝膠。
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