微生物基礎操作：微生物鑒定技術

1. 前言

本文主要介紹微生物實驗室微生物鑒定的范圍，分離技術，形態如何描述、基礎生化試驗、常見的微生物鑒定系統、鑒定結果出來后如何判斷來源及建議措施等內容。

2. 定義

2.1 鑒定：借助于現有的微生物分類系統，通過特征測定，確定未知的、或新發現的、或未明確分類地位的微生物所應歸屬分類群的過程。

2.2 培養物：一定時間一定空間內微生物的細胞群或生長物。如微生物的斜面培養物、搖瓶培養物等。

3. 內容

3.1 鑒定表1范圍的微生物

表1鑒定范圍

3.2.1 大多數非無菌藥品生產過程和部分無菌生產環境的風險評估中，對所檢出微生物的常規特征包括菌落形態學、細胞形態學、革蘭染色或其他染色特性，及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生化反應（如氧化酶、過氧化氫酶）進行分析，一般即可滿足需要。

3.2.2 無菌試驗結果陽性、無菌生產模擬工藝(如培養基灌裝)失敗、環境嚴重異常事件時，對檢出的微生物鑒定至少達到種水平，必要時需達到菌株水平。

3.2.3 微生物實驗室的標準菌種使用前需要進行驗收，包括形態學描述，基礎生化試驗等，條件具備的需要鑒定到種屬。

3.3 分離技術

3.3.1 分段劃線分離法

? 當菌苔或濃的菌液多用此法進行分離。從平板表面涂抹培養物的地方開始劃線，每劃連續的一組線段后，再與上段劃線相交數次劃出下一組的連續線段，如此劃到第四或第五段，合蓋即成。如圖1所示。

圖1 平板分段劃線（左）及培養后菌落分布示意圖

3.3.2 連續劃線分離法

? 含菌量較少的菌液多用此法進行分離。從平板表面涂抹培養物的地方開始劃線，連續向整個表面左右展開并一直劃完，形成一條接種曲線。如圖2所示。

圖2 平板連續劃線法（左）及培養后菌落分布示意圖

3.3.3 注意事項

? 劃線分離用的平板應保持適宜的濕度，在表面不能有凝集水，以免細菌在接種線蔓延生長，菌落相互依聯。

3.4 菌落形態表述

3.4.1 細菌形態表述

? 菌落形態從大小、形狀（圓形、假根形、不規則形等)、隆起形狀（如擴展、苔狀、低凸、凸面、乳頭狀等)，邊緣（整齊、波狀、裂葉狀、圓鋸齒狀、有緣毛等)，表面狀態（光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀、同心環狀等)，表面光澤（閃光、不閃光、金屬光澤等)，質地（油脂狀、膜狀、黏、脆等)，顏色，透明程度（不透明、半透明）等方面來描述。

3.4.2 霉菌形態表述

? 生長速度：培養一定天數、測量菌落直徑，以生長極慢、慢、中等、快等說明。

? 菌落表面：平滑或有皺紋、致密或疏松，有無同心環或輻射狀溝紋。菌落全部、中心及邊緣部分分別記錄。

? 色：表面、底部和菌落背面顏色及變化。

? 菌落質地：外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、束狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀等。

? 菌落邊緣：全緣、鋸齒、樹枝或纖毛狀。

? 菌落高度：扁平、丘狀隆起、陷役，或菌落中心部分凸起或凹路。

? 培養基顏色變化：菌落周圍有無色素擴散到培養基內。

? 滲出物：菌落表面有無帶顏色的液滴。

? 氣味:霉味、土氣味、芳香味、無味等。

3.4.3 酵母菌形態表述

? 酵母菌在玫瑰紅鈉瓊脂平板上的菌落表面濕潤、黏稠，類似細菌菌落，但多數為圓形乳白色，少數紅色，微凸、邊緣整齊，少數呈毛狀，偶有干皺型。

? 酵母菌為單細胞，無菌絲，故菌落不深入基質，與培養基結合不緊密，用接種環極易黏起菌落培養物。并在水中易分散。

? 在瓊脂內的菌落除圓形外，常有鐵餅形、三角及多角形。

3.5 基礎生化試驗

3.5.1 觸酶（過氧化氫酶）試驗

3.5.1.1  原理

? 具有過氧化氫酶的細菌培養物，加入過氧化氫試液，立即產生氣泡。

3.5.1.2 本試驗腸用于鑒別葡萄球菌、微球菌（陽性）與鏈球菌。乳酸菌及梭菌為陰性反應。

3.5.1.3  方法

? 用塑料接種環挑取菌落一環，置于潔凈載玻片上，滴加觸酶試劑數滴，立即觀察結果。如產生氣泡為陽性反應，不產生氣泡者為陰性反應。

3.5.2 氧化酶試驗

3.5.2.1  原理

? 氧化酶不直接與氧化酶試劑反應，而是首先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺試劑氧化，使之成為玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物。

3.5.2.2 本試驗主要用于奈瑟球菌屬鑒別，區別假單胞菌科與氧化酶陰性的腸桿菌科細菌。

3.5.2.3  方法

? 取潔凈的濾紙，用塑料無菌接種環挑取新鮮待檢菌的菌苔或菌落少許，涂于濾紙上，滴加氧化酶試劑，菌落立即呈現玫瑰紅色、繼而變深，并于30秒內呈現深紫色為陽性反應。不變色為陰性反應。或根據廠家說明書來進行操作。

3.5.3 注意事項

3.5.3.1 待檢菌應是純培養物，否則所觀察的生化反應可能是兩種或多種菌的混合反應，造成試驗紊亂，無法得出正確的鑒定結果。

3.5.3.2 待檢細菌最好采用18~24小時的新鮮培養物，此時細菌群體細胞的生理特征比較一致。培養時間過長或陳舊的培養物，細胞衰退，生理特征亦會發生改變，常會影響鑒定結果的準確性。

3.5.3.3 嚴格遵守觀察反應的時間，時間過短或過長，不能觀察到正確結果。

3.5.3.4 染菌的物品需要經過高壓121℃30min及以上溫度和時間的滅菌后,按照EHS要求處理。

3.6 酵母菌鑒定

? 當其外觀與細菌菌落不易區別時，可將平板置低倍顯微鏡下，觀察菌落邊緣。酵母菌菌落的邊緣由可分辨的小珠或魚卵狀酵母細胞組成。或挑取菌落少許，加水制成薄涂片、加蓋玻片，置高倍顯微鏡下觀察，可見比細菌大數倍的圓形、卵圓形并帶有芽體的酵母細胞，甚易識別。當平板內酵母菌菌落甚多時，常有酒香氣味。

? 必要時可進行基因型微生物鑒定。

3.7 霉菌鑒定

3.7.1 形態觀察

? 菌絲粗大，寬約4.0~8.0微米，無色透明或呈現各種鮮艷的顏色，有營養菌絲與繁殖菌絲之分。多數霉菌菌絲有分隔，為多細胞分枝絲狀體。菌落形態較大，質地蔬松，外觀干燥，不透明，菌落與培養基間連接緊密，不易挑取，菌落正反面，邊緣與中心的顏色、構造通常不一致，有霉味。

3.7.2 必要時可進行基因型微生物鑒定。

3.8 常見鑒定系統

3.8.1 BBL Crystal鑒定系統

是一種以熒光、顯色技術相結合的細菌鑒定系統，使用5種鑒定板條，采用30種鑒定反應，可在最短4小時內鑒定包括革蘭氏陽性菌、奈瑟/嗜血菌、厭氧菌、腸/非發酵菌在內的500多種微生物。

3.8.2 API鑒定系統

3.8.2.1 定義

法國梅里埃公司生產的基于數值分類鑒定技術，通過計算反應性狀出現的頻率來進行的一種小型的微生物鑒定系統。

3.8.2.2 API鑒定概率說明（圖3）

 圖3 API鑒定概率說明

3.8.2.3 如果第一個菌名的鑒定概率＞80%，則可將未知菌定為該菌名；

3.8.2.4 如果第一個菌名的鑒定概率＜80%，就將前面兩個菌加在一起，還不足80，就將第三個也加在一起，若其和超過80，如果這幾個菌都是同一個“種”內的不同生物型，則可稱為鑒定到種級水平；如果這幾個菌都屬于同一個屬內，則稱為鑒定到屬級水平。

3.8.2.5 如果頭三個菌的%id之和＜80，則此結果應定為不可接受的。

3.8.2.6 圖示舉例（好的鑒定結果）（圖4）

圖4好的鑒定結果

3.8.2.7 圖示舉例（可接受的鑒定結果）（圖5）

圖5可接受的鑒定結果

3.8.2.8 圖示舉例（低分辨率的鑒定結果）（圖6）

圖6低分辨率的鑒定結果

3.8.3 Vitek 2 compact全自動微生物鑒定儀

VITEK 2 COMPACT是全自動微生物系統用于鑒定細菌和酵母菌及藥敏試驗，微生物各自的新陳代謝不同，生化譜也就不同, 通過各種生化反應，包括酶的反應，酸化試驗，產堿試驗，同化試驗，抑制試驗等方法，根據顏色或濁度的變化，儀器自動判讀，達到判讀閾值時，自動處理生化譜，最終得出屬或種的鑒定結果。

3.8.4 全自動快速微生物質譜檢測系統

采用MALD-TOF技術（基質輔助激光解析電離飛行時間質譜）獲取質量圖譜并通過數據庫對其進行分析，從而完成微生物鑒定。

3.9 鑒定時常見污染菌來源及建議措施（供參考），見表2。

表2 常見污染菌來源及建議措施（供參考）