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內標在傳統定量PCR中的意義
發布日期:2022-07-02 09:55:39


內標在傳統定量PCR中的意義


內參照法


  在不同的
PCR 反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR 產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。

 

競爭法


  
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR 產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

 

PCR ELISA 法


  利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗地高辛或生物素酶標
抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR -ELISA 法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。

內標在傳統定量中的作用


   由于傳統定量方法都是終點檢測,即PCR 到達平臺期后進行檢測,而PCR 經過對數期擴增到達平臺期時,檢測重現性極差。同一個模板在96 孔PCR 儀上做96 次重復實驗,所得結果有很大差異,因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后,可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。



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