重組質粒構建

來自網友

重組質粒構建是常用的分子生物學手段，其實只是最基本的方法

所涉及內容如下：

1) 克隆基因的酶切位點問題

2) 載體酶切的問題

3) 連接片段濃度比的問題

在闡明上述問題同時，本人盡可能舉些實驗中的問題案例予以說明。

一、克隆基因的酶切位點問題

1、克隆位點選擇的問題。首先要對目標基因進行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。然后對照質粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標基因所不含的酶切位點。這是常識，不贅述。

2、保護堿基數目的問題。在設計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護堿基，這是大家所熟知的。但是保護堿基數量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會大大影響后續的實驗進展。

一般情況下，普通的內切酶只加入兩個保護堿基，其內切反應就可以正常進行；而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內切反應就不能正常進行，這是因為內切酶不能正常結合DNA片段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。

下面是提供這類酶的列表及其所需最少的保護堿基數，相信下列將有助于大這家的實驗設計。

案例分析一：曾選用NdeI克隆位點，未注意到保護堿基數目的問題，設計PCR引物時，引入NdeI酶切位點后，只加上兩個保護堿基，一個月內沒有進展，始終不能成功構建重組載體。后查文獻得知癥結所在，在NdeI序列后加上六個保護堿基后，迎刃而解。大家引以為戒。

現在普通酶我都引入三個保護堿基。現在堿基合成價格也不貴了，為保證酶切充分，連接順利，不用節約那點錢，再說若一次不成功，重復實驗花費時間與金錢更多

二、載體酶切的問題

1、質粒的單酶切鑒定。這個問題似乎很簡單，但我認為很有著重強調之必要。現在大家手頭的質粒都是轉來轉去的，其中的各酶切位點狀況如何，是否能被有效地切開，這些問題都是要核實的。因此，在實驗開始之前必須對質粒載體進行單酶切鑒定。

現在我每次構建之前，對所選擇的克隆位點都要作一一鑒定，例如選擇NdeI和HindIII作為克隆位點，就先分別對質粒上這兩個酶的酶切位點進行單酶切鑒定。單酶切鑒定能有效地切開后，再發出引物合成定單，進行引物合成；若不能，就按“一”中原則進行調換。

2、連接反應的對照。在實驗中，這步驟屬于質粒載體與外源DNA片段的連接反應。成功與否，很大程度上取決于與質粒和DNA片段的酶切效果。

一般情況下，都在通用緩沖液中進行雙酶切，但這兩種酶在通用緩沖液中酶切效率不一樣，這可能導致部分的單缺口的質粒片段存在，這樣，在連接反應中，即使在外源DNA片段存在下，這種單缺口的質粒片段能夠進行更快速有效自我連接。

最終結果是大量假陽性的菌斑生長。對照連接反應中，在不加入外源片段情況下，實驗結果如果有菌斑生長，說明雙酶切不充分，質粒DNA必須重新進行雙酶切。

實驗案例分析2：曾用XhoI和HindIII酶切位點構建重組質粒，對質粒進行雙酶切后，直接就做連接，未上述兩步鑒定，每次結果滿板的菌斑。但就是沒有陽性。后來對質粒進行單酶要鑒定后，發現XhoI酶切位點損壞。又是一個月沒有進展，浪費精力和藥品。

血的教訓啊。因為當時沒有注意到：單切質粒是一條帶，雙切質粒也是一條帶，電泳行為上是一樣的，分辨不出。如果做上述任何一個鑒定就會知道問題出在那兒，呵呵。

實驗案例分析3：本實驗室一個號稱實驗嚴謹的大博士，用KpnI和HindIII構建重組質粒，一個月未果，只得陰性斑，不得陽性斑，后懷疑KpnI酶失效。遷怒KpnI，在我不知情下扔掉實驗室所有KpnI酶。我得知后，問他做過上述兩鑒定實驗后，他支吾著說沒有，后經鑒定HindIII位點失效。

三、連接時兩片段濃度比問題

一般實驗指導手冊上都說質粒：片段＝1：3（摩爾比），在實際操作中我以為在1：5甚至1：10為宜。做好“一、二”，16℃ 10小時后，每次都能有效地連接上。當然還有大腸桿菌感受覺態問題，我們以前自己做，現在懶得做了，都用“天為時代公司”的產品，感覺還不錯（特別聲明我不是天為公司內線，呵呵）。

這里介紹一個估測處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測，也可以電泳對比marker估測，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法：

1．取一平皿。

2．薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固 (4 ℃可以存一個星期)。

3．平皿背面可以畫成小方格。

4．一小格中點1 ul樣品。

5．另一小格格點1 ul DNA標準品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相當60 ng)

6．涼干后，紫外燈下根據亮度就可以估測了。

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