血清淀粉樣P物質(zhì)(SAP)重組蛋白的應(yīng)用

一、背景

血清淀粉樣P物質(zhì)(SAP)重組蛋白是一種小的非纖維狀的糖蛋白。為五角形結(jié)構(gòu)。是許多基底膜的組成成分。常在血清和多數(shù)淀粉樣沉積物中出現(xiàn)。能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制彈性蛋白酶，是肝臟損傷的標(biāo)志。

血清淀粉樣P物質(zhì)(serum amyloid P component,SAP),作為一種古老的蛋白質(zhì),與C反應(yīng)蛋白(CRP)構(gòu)成血清正五聚蛋白家族,其系統(tǒng)發(fā)生學(xué)非常保守,表明具有重要生理功能。

血清淀粉樣P（Serum amyloid P,SAP）物質(zhì)與C反應(yīng)蛋白（C reactive protein,CRP）和正五聚蛋白3（pentraxin 3,PTX3）同屬正五聚體家族,它們與炎癥免疫反應(yīng)有著不可分割的聯(lián)系。最初SAP是作為一種淀粉樣沉積蛋白為人們所認(rèn)識,認(rèn)為其在系統(tǒng)性淀粉樣變性疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,后來,研究逐漸發(fā)現(xiàn)SAP參著與體內(nèi)的固有免疫、炎癥反應(yīng)、淀粉樣變等多種活動,近年來SAP在心血管方面的作用也漸漸為人們所認(rèn)識。

重組蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。在基因工程技術(shù)中占有核心地位。編輯本段蛋白表達(dá)系統(tǒng)概述蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)的目的。一般由以下幾個部分組成:

1、宿主。表達(dá)蛋白的生物體?？梢詾榧?xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等。由于各種生物的特性不同,適合表達(dá)蛋白的種類也不相同。

2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同,分為原核(細(xì)菌)表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、哺乳動物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導(dǎo),外源基因可以在宿主中表達(dá)。

3、輔助成分。有的表達(dá)系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進(jìn)入宿主的輔助成分。

二、應(yīng)用

用于血清淀粉樣P物質(zhì)對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制研究：

通過不同濃度的SAP作用RAW264.7細(xì)胞,觀察SAP對RAW264.7分泌炎癥因子、產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物等的影響,并且觀察其對炎癥相關(guān)的機(jī)制蛋白的影響,探尋SAP對炎癥免疫反應(yīng)作用的可能機(jī)制。

研究方法：

1、細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基,在每次實(shí)驗(yàn)前將巨噬細(xì)胞密度調(diào)整為1×10+個／孔,加入6孔板中,無血清培養(yǎng)基饑餓24h后,對照組不予以處理,SAP組加入不同濃度SAP刺激24h后,收取樣本檢測。實(shí)驗(yàn)分為4組：1)空白對照組,2)SAP 1.25ug/ml組,3)SAP 2.5ug/ml組,4)SAP 5ug/ml組。

2、不同濃度的SAP對RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響用不同濃度的SAP作用RAW264.7細(xì)胞24h后,收集細(xì)胞上清,用ELISA檢測細(xì)胞上清炎癥因子白介素1-β（interleukin-1β）、腫瘤壞死因子-a（Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a）以及氧化應(yīng)激指標(biāo)一氧化氮（Nitric Oxide,NO）的分泌,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）及炎癥相關(guān)Fcy受體的表達(dá),并用RT-PCR復(fù)測IL-1β、TNF-a及ICAM-1 mRNA的表達(dá)。

3、不同濃度的SAP對炎癥相關(guān)機(jī)制蛋白的影響用不同濃度的SAP作用RAW264.7細(xì)胞24h后,RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白,用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測Fcγ受體通路下游蛋白脾酪氨酸蛋白激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）的表達(dá),以及炎癥相關(guān)的MAPK家族蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK 1/2）、磷酸化ERK1/2（pERK）的表達(dá)。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,并采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,多組間總體均數(shù)比較,在方差齊時采用單向方差分析（one-way ANO VA）,方差不齊時采用Welch校正檢驗(yàn)。多個樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時采用LSD法檢驗(yàn),方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究結(jié)果：

1、不同濃度的SAP對細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1及活性氮NO的分泌的影響結(jié)果顯示,SAP可促進(jìn)炎癥因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1以及活性氮NO的分泌,且這種作用有一定的濃度依賴性。與空白對照組相比,SAP三組中IL-1β的表達(dá)量均明顯升高,2.5ug/ml及5ug/ml組的fNF-a相較對照組與1.25ug/ml組均有明顯升高趨勢,5ug/ml組的ICAM-1和NO分泌相較于對照組和1.25ug/ml組均明顯升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余幾組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是仍有隨濃度升高分泌增加的趨勢。

2、不同濃度SAP對炎癥因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示,與空白對照組相比,加入SAP刺激之后,三種炎癥因子的nRNA表達(dá)量均有明顯增高,且有一定的濃度依賴性。5ug/ml組的三種炎癥因子分泌與其他三組之間均有明顯升高趨勢,2.5ug/ml組的IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)相較于空白對照組和1.25ug/ml組均有升高,結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余幾組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是仍有隨濃度升高分泌增加的趨勢。

3、不同濃度的SAP對炎癥相關(guān)機(jī)制蛋白的影響SAP刺激后Syk明顯增加,相較于空白對照組,1.25ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml組Syk表達(dá)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且2.5ug/ml組與5ug/ml組相較1.25ug/ml組Syk表達(dá)量亦有升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而SAP作用后Fcγ受體、pERK 1/2的表達(dá)并無明顯改變,和空白對照組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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