TRIzol RNA提取方法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，采用變性劑即內(nèi)含異硫氰酸胍酚和β-巰基乙醇等變性物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。 細(xì)胞裂解后，細(xì)胞釋放出蛋白質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)，再根據(jù)它們?cè)诓煌腜H值和不同極性溶劑的溶解度不同而使得分開。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 細(xì)胞樣品 |
| 試劑、試劑盒 | TRIzol試劑 氯仿 異丙醇 75%乙醇 DEPC H2O |
| 儀器、耗材 | 離心管 離心機(jī) EP管 勻漿器 移液管 冰袋 漩渦振蕩器 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 樣品處理： （1） 培養(yǎng)細(xì)胞： 收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。 （2） 組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。 2. 加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。 3. 4℃離心，12000g×15min，取上清。 4. 加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。 5. 4℃離心，12000g×10min，棄上清。 6. 加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。 7. 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min） |
| 注意事項(xiàng) | 1.樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會(huì)使內(nèi)源性RNase的抑制不完全，導(dǎo)致RNA降解。 2.實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格防止RNsae的污染。 |
| 其他 | 一、RNA的定量計(jì)算 1. RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度： RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)（n）/1000 2. RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。 |
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