LCR
連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.
連接酶鏈反應(yīng)是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)發(fā)明，并申報(bào)了專利.1988年Landegren也進(jìn)行了該項(xiàng)研究.1988年Backman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申報(bào)專利，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進(jìn)行了LCR試驗(yàn).耐熱DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序.
LCR的基本原理為利用DNA連接酶.特異地將雙鏈DNA片段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增.其程序?yàn)?在模DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開(kāi)，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增.若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物.
LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長(zhǎng)度為20～26個(gè)，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識(shí)別單核苷酸錯(cuò)配的特異性極高.
LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個(gè)溫度循環(huán)，94℃min變性和65℃復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右.其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏.目前該方法主要用點(diǎn)突變的研究與檢測(cè)、微生物病原體的檢測(cè)及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究等.
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