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氨基酸紙層析
發(fā)布日期:2022-10-09 08:46:59


氨基酸紙層析


一、原理:氨基酸混合液經(jīng)紙上層析,由于不同的氨基酸有不同的分配系數(shù),移動(dòng)速率不同,從而達(dá)到分離。經(jīng)顯色后,與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜比較或與氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)Rf值比較,可辨別各種氨基酸。


二、材料與試劑
1、酸向展開劑:正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2,量取正丁醇150ml,88%甲酸30ml,蒸餾水20ml,置入分液漏斗中充分振蕩。此液需新配制。
2、12%氨水:量取60ml濃氨水,加入70ml蒸餾水稀釋。
3、堿向展開劑:正丁醇:12%氨水=13:3,量取130ml正丁醇,30ml12%氨水,置于分液漏斗中充分振蕩。
4、0.2%茚三酮顯色液:稱取0.2g茚三酮,溶于100ml丙酮中。
5、0.5%標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液:稱取各種氨基酸各0.5g,分別置于100ml容量瓶中,用10%異丙酮溶液溶解,定容至刻度。
6、微量注射器、層析缸、新華濾紙、噴霧器、氨基酸混合液(可任選2-3種)


表2-4 各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)Rf值


氨基酸標(biāo)準(zhǔn)Rf值氨基酸標(biāo)準(zhǔn)Rf值
第一相(酸向)第二相(堿相)第一相(酸向)第二相(堿相)
天門冬氨酸
谷氨酸
賴氨酸
精氨酸
組氨酸
甘氨酸
羥丁氨酸
r-氨基丁酸
丙氨酸
酪氨酸
0.27
0.35
0.12
0.15
0.11
0.30
0.37
0.46
0.47
0.25
0.01
0.01
0.03
0.05
0.10
0.06
0.10
0.08
0.14
0.23
蛋氨酸
頡氨酸
色氨酸
異亮氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
胱氨酸
絲氨酸
脯氨酸
0.64
0.67
0.64
0.77
0.79
0.73
0.08
0.28
0.48
0.31
0.32
0.48
0.52
0.57
0.58
0.02
0.06
0.16

三、操作


1、層析濾紙的準(zhǔn)備:取兩張19cm×23cm的新華濾紙一號(hào),在右下角距二底邊各2cm交點(diǎn)處用鉛筆畫一原點(diǎn),同時(shí)畫出二邊的原線。


2、點(diǎn)樣:將10ul樣品液點(diǎn)于一張濾紙?jiān)c(diǎn)上,用微量注射器分多次點(diǎn)完。點(diǎn)一次后,吹干再點(diǎn)第二次。點(diǎn)的直徑應(yīng)小于0.5cm。


3、展開:將點(diǎn)樣后的兩張濾紙?jiān)谙嗤牟僮鳁l件下用上行法進(jìn)行雙向展開。

(1)第一向(酸相)展開:以濾紙19cm長的一邊為高,用線縫成圓筒形(注意紙的兩邊不相碰),放在盛有酸相展開劑的層析缸內(nèi)飽和1h。然后將點(diǎn)樣端放入展開劑中,待溶液前沿上升至離頂端1cm左右時(shí)取出,吹干至無正丁醇?xì)馕稙橹埂?/span>

(2)第二向(堿相)展開:把濾紙轉(zhuǎn)900,以23cm長的一邊為高,用線縫成圓筒形(注意紙的兩邊不相碰),放在盛有堿相展開劑的層析缸內(nèi)飽和1h。然后將點(diǎn)樣端放入展開劑中,待溶液前沿上升至離頂端1cm左右時(shí)取出,吹干。然后以同樣條件,再在堿相展開劑中展開一次,取出吹干。


4、顯色:展開結(jié)束后,濾紙用0.2%茚三酮溶液噴霧顯色,65℃烘干。


四、定性鑒定:用樣品的層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜的層析圖譜相比較,根據(jù)Rf值的大小,確定樣品中氨基酸的種類。



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