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還原糖和總糖的測定3,5
發布日期:2022-09-30 08:12:38


還原糖和總糖的測定3,5


一、目的


掌握還原糖和總糖測定的基本原理,學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。


二、原理


還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類,單糖都是還原糖,雙糖和多糖不一定是還原糖,其中乳糖和麥芽糖是還原糖,蔗糖和淀粉是非還原糖。

利用糖的溶解度不同,可將植物 樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來,對沒有還原性的雙糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定,再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計)。

還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物,3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內,還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系,利用分光光度計,在540nm 波長下測定光密度值,查對標準曲線并計算,便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。

由于多糖水解為單糖時,每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子 水,所以在計算多糖含量時應乘以0.9。

三、實驗材料、主要儀器和試劑


1. 實驗材料

小麥面粉;精密pH 試紙。


2. 主要儀器

(1)具塞玻璃刻度試管:20mL×1

(2)大離心管:50mL×2

(3)燒杯:100mL×1

(4)三角瓶:100mL×1

(5)容量瓶:100mL×3

(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1

(7)恒溫水浴鍋

(8)沸水浴

(9)離心機

(10)扭力天平

(11)分光光度計


3. 試劑

(1)1mg/mL 葡萄糖標準


準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg,置于小燒杯中,加少量蒸餾水溶解后,轉移到100mL 容量瓶中,用蒸餾水定容至100mL,混勻,4℃冰箱中保存備用。


(2)3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑

將6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液,加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加5g 結晶酚和5g 亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。


(3)碘-碘化鉀溶液:稱取5g 碘和10g 碘化鉀,溶于100mL 蒸餾水中。


(4)酚酞指示劑:稱取0.1g 酚酞,溶于250mL 70%乙醇中。


(5)6M HCl 和6M NaOH 各100mL。


四、操作步驟


1. 制作葡萄糖標準曲線

取7 支20mL 具塞刻度試管編號,按表1 分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑,配成不同葡萄糖含量的反應液。


將各管搖勻,在沸水浴中準確加熱5min,取出,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至20mL,加塞后顛倒混勻,在分光光度計上進行比色。調波長540nm,用0 號管調零點,測出1~6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標,葡萄糖含量(mg)為橫坐標,在坐標紙上繪出標準曲線。



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