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RT-PCR實驗步驟
發布日期:2022-06-30 10:42:22


RT-PCR實驗步驟


一、組織抽提:


1. 取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末


2. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿


3. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打


4. 冰上孵育5分鐘


5. 離心12,000g 4℃ 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管


6. 加0.2 ml氯仿,震蕩,冰上孵育5分鐘


7. 離心<12,000g 4℃ 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管


8. 加0.5 ml異丙醇,震蕩,冰上孵育5分鐘


9. 離心<12,000g 4℃ 5分鐘 棄去上清液


10. 加入1 ml 75%乙醇,震蕩


11. 離心<7,500g 4℃ 5分鐘 棄去上清液


12. 室溫下使之變透明


13. 加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA( 可保存在液氮或低溫冰箱


14. 走RNA變性電泳觀察18s,28s條帶,分光光度計檢測260/280吸光度比值,計算RNA濃度


二、RT反應體系(第一步):約20分鐘


RNA 抽提物


5μl


Radome 引物


2μl


RNA sin


0.5μl


1. 65℃ 15分鐘


2. 立即放入冰浴





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