血清脂類測(cè)定方法
脂蛋白和脂質(zhì)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)血漿脂蛋白和脂質(zhì)測(cè)定是臨床生化檢驗(yàn)的常規(guī)測(cè)定項(xiàng)目，其臨床意義主要是：早期發(fā)現(xiàn)與診斷高脂蛋白血癥；協(xié)助診斷動(dòng)脈粥樣硬化癥；評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化疾患如冠心病和腦梗塞等危險(xiǎn)度；監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)飲食與藥物治療效果。
一、血漿脂蛋白測(cè)定
1、超速離心分離純化法超速離心法是根據(jù)血漿中各種脂蛋白的比重（密度）的差異，在強(qiáng)大離心力作用下進(jìn)行分離純化的一種方法。
血漿在不同密度鹽溶液中經(jīng)過(guò)超速離心，各種脂蛋白可按密度大小漂浮于不同鹽溶液介質(zhì)中。脂蛋白漂浮的衡量單位是漂浮率(Sf)。
Gofman等于1950年確定，血漿脂蛋白在比重為1.063的NaCl溶液中（26℃），每秒每達(dá)因（ldyn=10-5N）克離心力的作用下的漂浮速度，稱為1個(gè)Svedbery單位（10-13s）。
Sf越大，脂蛋白密度越低。
一般操作方法是將血漿置于已準(zhǔn)備好的不同密度梯度的鹽溶媒介質(zhì)中，在強(qiáng)大離心作用下，各脂蛋白依其自身的Sf不同，分散于離心管中的密度梯度溶媒層，達(dá)到分離純化的目的。超速離心法是分離純化脂蛋白的有效技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于脂蛋白、載脂蛋白代謝的研究中。
2、電泳分離法不同脂蛋白因蛋白質(zhì)含量不同、其電荷量不同，故可用電泳方法進(jìn)行分離，并根據(jù)血漿脂蛋白電泳遷移率不同予以判斷確認(rèn)。電泳支持物一般常用醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠或聚丙酰胺凝膠。
由于醋酸纖維薄膜要預(yù)處理，很繁雜，外加電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，目前已很少使用。
臨床檢驗(yàn)中主要采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，快而較為準(zhǔn)確，儀器設(shè)備要求不高，被廣泛采用。聚丙烯酰胺凝膠作為支持物分離脂蛋白，值得推薦給臨床使用。
電泳分離法不論用何種支持物，血漿脂蛋白需用親脂染料如蘇丹黑B等進(jìn)行預(yù)染再電泳，電泳完畢，脂蛋白根據(jù)電荷量不同，移動(dòng)在不同的位置，再置于光密度計(jì)內(nèi)進(jìn)行掃描，計(jì)算出各種脂蛋白的百分比，該數(shù)值乘以血漿總脂量，即可求出α-脂蛋白、β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量，乳糜微粒停留在原點(diǎn)，無(wú)法測(cè)出其含量，正常空腹12h后，血漿中無(wú)CM存在。
也可將電泳畢的瓊脂糖凝膠脂蛋白區(qū)帶切割置于試管中，加水溶解，進(jìn)行比色，測(cè)出各自百分比，這一手工半定量法無(wú)法測(cè)準(zhǔn)，屬淘汰之列。
⒊沉淀分離法由于脂蛋白的組成及理化性質(zhì)不同，在不同的聚陰離子和2價(jià)不同金屬離子（Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+）以及不同pH值條件下，使脂蛋白與聚陰離子結(jié)合形成復(fù)合物沉淀，以達(dá)到分離定量各種脂蛋白的目的。
如肝素錳沉淀血清中VLDL和LDL，離心沉淀，HDL則留在上清液，再定量HDL量，即為血漿HDL的量。
也可采用聚乙烯硫酸鹽沉淀LDL，離心去上清液留沉淀，再定量沉淀其中的LDL，即血漿的LDL量。
脂蛋白是一種既有蛋白質(zhì)又有膽固醇，還有磷脂的復(fù)合體，如何定量，尚無(wú)一種較為理想的方法。
目前僅以測(cè)定脂蛋白中膽固醇總量的方法作為脂蛋白的定量依據(jù)，即測(cè)定HDL、LDL或VLDL中的膽固醇，并分別稱為高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）或極低密度脂蛋白-膽固醇（VLDL-C）。
這類測(cè)定方法是目前臨床廣泛使用的方法，快速并較為準(zhǔn)確。⒋遮蔽直接測(cè)定法利用脂蛋白中某種特異抗體等物質(zhì)，先將血漿中LDL和VLDL包裹保護(hù)，不受測(cè)定膽固醇試劑的影響，而直接測(cè)定未被包裹的HDL中的膽固醇，在不離心分離條件下，測(cè)定出HDL的膽固醇含量，快速準(zhǔn)確，是近年來(lái)發(fā)展的新技術(shù)，值得推廣應(yīng)用。
二、血清總脂質(zhì)測(cè)定
血清總脂質(zhì)主要包括FC、CE、PL和TG等。血清總膽質(zhì)測(cè)定除作為脂質(zhì)代謝紊亂及有關(guān)疾患的協(xié)助診斷外，還可用于血總脂增加的原發(fā)性膽汁酸肝硬化、腎病綜合征或急慢性肝炎以及血總脂減少的重癥肝炎、肝硬化等的嚴(yán)重肝實(shí)質(zhì)性損害、惡液質(zhì)、甲狀腺功能亢進(jìn)和吸收不良綜合征等疾患的協(xié)助診斷。血總脂一般隨年齡增加而升高，40歲以上者顯著增加，65-70歲者反而降低。測(cè)定方法不同，正常參考值有一定的差異。測(cè)定方法分兩大類：一類是抽提法，將血清脂質(zhì)通過(guò)脂質(zhì)抽提劑提入某一介質(zhì)中，再進(jìn)行定量；另一類是直接測(cè)定法，即無(wú)需抽提。
1、脂質(zhì)抽提法脂質(zhì)存在于血清脂蛋白中，利用甲醇或乙醇使其與蛋白結(jié)合的脂質(zhì)分離，再利用甲醇或乙醇的非極性有機(jī)溶媒使脂質(zhì)溶于其中。Bloor溶劑（醚：醇為1：3，V/V）或FovCh溶劑（氯仿：甲醇為2：1，v/V）的醚氯仿等非極性溶劑的混合液，可提高切斷脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合的能力，達(dá)到抽提的目的。血清脂質(zhì)抽提入有機(jī)溶液后，蒸發(fā)干固，除去有機(jī)溶液，通過(guò)加熱氧化，再顯色定量。
2、脂質(zhì)直接測(cè)定法如Sulfo-phospho-Vanillin法是加濃硫酸入血清加熱，冷卻后，加試劑顯色（即SPV反應(yīng)）直接測(cè)定出血清總脂質(zhì)。
三、膽固醇測(cè)定
血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70％，游離型FC占30％。FC中的C3的-OH在LACT作用下，可分別與亞油酸（43％）、油酸（24％）、軟脂酸（10％）、亞麻油酸（6％）、花生四烯酸（6５）、硬脂酸（3％）等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL，CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。
⒈化學(xué)法化學(xué)法一般包括：
①抽提；
②皂化；
③毛地黃皂苷沉淀純化；
④顯色比色四個(gè)階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，包括①到④步驟操作過(guò)程，常規(guī)操作中多省去了②、③。或者用省去②、③步驟的Zak-Henly法及省去③步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以利用。
⒉酶法測(cè)定CE在膽固醇酯酶（cholesterolesterase,CHE）作用下水解成FC和FFA，F(xiàn)C再經(jīng)膽固醇氧化酶（cholesteroloxidase，COD）氧化成△4膽甾烯酮和H2O2，再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4膽甾烯酮生成量，以作為FC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)應(yīng)用方法，快速準(zhǔn)確，標(biāo)本用量少，便于自動(dòng)生化分析器作批量測(cè)定。
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