常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)簡(jiǎn)介

核酸分子雜交技術(shù)

由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。

雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）,待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

固相雜交

固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱(chēng)為膜上印跡雜交。

斑步雜交（dot hybridization）

是道先將被測(cè)的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過(guò)量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，事先不用限制性?xún)?nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽(yáng)性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性。

印跡雜交（blotting hybridization）

Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測(cè)特定大小分子的含量?？蛇M(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RELP）等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來(lái)，其被測(cè)樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法，可推臬出癌基因的表達(dá)程度。

差異雜交（differential hybridization）

是將基因組文庫(kù)的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對(duì)應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物（如酵母）表達(dá)基因的比較，假陽(yáng)性率較低。但對(duì)基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達(dá)的序列所占百分比較低（僅5％左右），價(jià)值不大。

cDNA微點(diǎn)隈雜交（cDNA microarray hybridization）

是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點(diǎn)陣，然后用混合的不同DNA探針與微點(diǎn)陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點(diǎn)陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問(wèn)世。其缺點(diǎn)是無(wú)法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。

寡核苷酸微點(diǎn)隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）

是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面，與平均長(zhǎng)度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測(cè)跨越三個(gè)數(shù)量級(jí)的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測(cè)，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。

液相雜交（solution hbridization）

指使變性的待測(cè)核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開(kāi)，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測(cè)的核酸量。

遞減雜交（subtractive hybridizatio）

是利用兩種來(lái)源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過(guò)量的驅(qū)動(dòng)mRNA或cDNA與測(cè)試的單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過(guò)羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫(kù)，可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長(zhǎng)序列。

核酸原位雜交

用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級(jí)或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法，稱(chēng)為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來(lái)檢測(cè)DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布，與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏；還用于細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性菌、病毒檢測(cè)的研究。

該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可精確定位；能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測(cè)等研究。近年來(lái)由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。

DNA分子克隆技術(shù)（也稱(chēng)基因克隆技術(shù)）

在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性?xún)?nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。

載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomic library）,另一種是cDNA庫(kù)。

載體　 所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。

細(xì)菌質(zhì)粒 是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對(duì)細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。

噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線(xiàn)性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。

黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。

表達(dá)型載體 將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動(dòng)基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達(dá)型載體。

基因庫(kù)的建造

含有某種生物體全部基歷的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過(guò)標(biāo)記探針與基因庫(kù)中的重組子雜交等方法而篩選出來(lái)，所得到的克隆經(jīng)過(guò)純化和擴(kuò)增，可用于進(jìn) 一步的研。其主步驟包括：

（1）構(gòu)建基因庫(kù)迅速的載體；

  (2)DNA片段的制備；

（3）DNA片段與載體DNA的連接；

（4）包裝和接種。cDNA庫(kù)的建造

是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫(kù)包括某特定細(xì)胞的全部cDNA克隆的文庫(kù)，不含內(nèi)含子。

特異基因的篩選

常用的方法有：

（1）克隆篩選即探針篩選法；

（2）抗體檢測(cè)法，檢測(cè)其分泌蛋白質(zhì)來(lái)篩選目的基因；

（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；

（4）免疫沉淀法，進(jìn)行特異基因的篩選。

核酸序列測(cè)定

DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測(cè)序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無(wú)論從基因庫(kù)中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，最終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性?xún)?nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對(duì)功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測(cè)序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。

目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來(lái)已有DNA序列自動(dòng)測(cè)定儀問(wèn)世。化學(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素，然后用專(zhuān)一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測(cè)讀序列和進(jìn)行比較。

一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長(zhǎng)，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長(zhǎng)衙不一、不同專(zhuān)一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用，合成的引物容易獲得，測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，故此法已被廣泛應(yīng)用?；撗醴ǖ淖詣?dòng)激光熒光測(cè)序儀，使測(cè)工作更快速和簡(jiǎn)便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測(cè)序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測(cè)序，然后反推RNA序列

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（甚至少到1個(gè)拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。

僅需用極少量模板，在一對(duì)引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100萬(wàn)-200萬(wàn)份拷貝。PCR反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板，這樣經(jīng)過(guò)九小時(shí)的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，這樣經(jīng)過(guò)數(shù)上時(shí)的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共進(jìn)行30次循環(huán)左右，最后再延伸72℃5分鐘，4℃冷卻終止反應(yīng)。

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來(lái)擴(kuò)增RNA的方法。

2.競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。

3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對(duì)引物可用于基天長(zhǎng)度很長(zhǎng)，發(fā)生多處缺失的檢測(cè)。擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。

4.多種PCR可同時(shí)加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。

5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對(duì)一個(gè)已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。

6.不對(duì)稱(chēng)PCR在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度，以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測(cè)定，以了解目的基因的序列。

7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來(lái)的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補(bǔ)的引物連接于一段帶限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的錨上，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下，將未知序列擴(kuò)增出來(lái)。

8.著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒，分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，反應(yīng)完畢后，利用分子篩選去多余的引物。用紫外線(xiàn)照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色。

9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃?？梢蕴岣叻磻?yīng)的速度和特異性。

上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用：

（1）PCR技術(shù)擴(kuò)增特定序列為基礎(chǔ)，采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；

（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中的特殊片段，產(chǎn)生針對(duì)尚未克隆的基因的探針；

（3）從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫(kù)；

（4）產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA；

（5）分析 基因突變；（6）做染色體步移。

10.原位PCR技術(shù)：PCR雖然能擴(kuò)增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA，但擴(kuò)增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位，因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系，這是該技術(shù)一個(gè)局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由于其敏感性問(wèn)題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測(cè)出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)IS PCR），它可使擴(kuò)增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位，從而彌補(bǔ)了PCR和原位雜交的不足，具有良好的應(yīng)用前景。目前，已有多種設(shè)計(jì)的原位PCR擴(kuò)增儀系統(tǒng)問(wèn)世，使操作簡(jiǎn)便，軟件靈活，已成為拉增固定細(xì)胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。

IS PCR的技術(shù)特點(diǎn)

（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性；

（2）測(cè)到低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列，甚至可檢測(cè)出單一細(xì)胞中的僅含一個(gè)拷貝的原病毒DNA；

（3）有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析；

（4）可用于正常或惡性細(xì)胞，感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事，實(shí)質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴(kuò)增后再進(jìn)行原位雜交的技術(shù)，操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過(guò)程，首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

初步應(yīng)用

有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報(bào)道是對(duì)感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查，通過(guò)PCR擴(kuò)增，僅用150堿基對(duì)的短探針就可通過(guò)ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒。從開(kāi)始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴(kuò)增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法（間接法），也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物，讓標(biāo)記物擴(kuò)增后再行ISH檢查的直接法。

因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統(tǒng)一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡(jiǎn)便，各家報(bào)道的原位PCR技術(shù)中，在標(biāo)本處理和種類(lèi)上尚不同（細(xì)胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測(cè)的靶核酸也不同（病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA），擴(kuò)增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗(yàn)，以求一致。

原位PCR應(yīng)用的課題，目前正片于開(kāi)始階段，還很局限，對(duì)人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對(duì)人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測(cè)定，歸納起來(lái)，主要應(yīng)用于兩方面；

（1）檢測(cè)外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；

（2）內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將特定的遺傳信息傳遞到真核細(xì)胞中，這種能力不但革新了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中許多基本問(wèn)題的研究，也推動(dòng)了診斷和治療方面的分子技術(shù)發(fā)展，并使基因治療成為可能。目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已廣泛用于基因的結(jié)構(gòu)和功能分析、基因表達(dá)與調(diào)控、基因治療與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等研究。本部分將介紹目前基因轉(zhuǎn)移的主要方法；重點(diǎn)介紹基因轉(zhuǎn)移的病毒方法的基因轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)。

基因運(yùn)載系統(tǒng)

將某一特定的靶基因傳遞到靶細(xì)胞，需要應(yīng)用某一基因運(yùn)載系統(tǒng)，目前將這一系統(tǒng)概括為兩大類(lèi)：非病毒辣方法和病毒方法。

1.基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法

直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細(xì)胞攝入DNA燕進(jìn)行表達(dá)，在肌細(xì)胞中，基因表達(dá)可持續(xù)數(shù)月。

磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細(xì)胞膜并經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用耐是入細(xì)胞質(zhì)。該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低。

脂質(zhì)體染法 指質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運(yùn)載外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢(shì)在于能在活體內(nèi)應(yīng)用。

受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 依靠受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細(xì)胞表面的肥體所識(shí)別。如若將DNA在體內(nèi)運(yùn)送至肝內(nèi)，可以選將DNA和能與肝細(xì)胞受體特異結(jié)合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應(yīng)用該方法轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短，在評(píng)估實(shí)際應(yīng)用前影上還在一些問(wèn)題。

顯微注射法 在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細(xì)胞玻璃針地接注入細(xì)胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞，但需要一定的設(shè)備和操作用支巧。

電穿孔法 利用脈沖場(chǎng)將DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。

微粒子轟擊法（基因槍?zhuān)┙鼛啄臧l(fā)展較快的轉(zhuǎn)移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入培胞或活的哺乳動(dòng)物組織內(nèi)。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將這些微彈加強(qiáng)速到很的速度轟擊細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。

胚胎干細(xì)胞法 胚胎干細(xì)胞是從受精卵開(kāi)始分裂至4個(gè)國(guó)胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細(xì)胞，能在體外培養(yǎng)，可作為正面細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以研究基因定向整合或基因剔險(xiǎn)及基因及能。

精子載體法 最近發(fā)現(xiàn)用精子和NDA-劑孵育，可捕獲得DNA。通過(guò)受精過(guò)程，將外源性基因?qū)胧芫?，可捕獲得物物，大大間化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備過(guò)程。

2.基因轉(zhuǎn)移的病毒的方法

病毒作為基因轉(zhuǎn)移的是基因遞送有有并工具，病毒載體的優(yōu)點(diǎn)有：

（1）在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分；

（2）在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調(diào)節(jié)信號(hào)的控制下以進(jìn)行研究；

（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進(jìn)分離；

（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其主要缺點(diǎn)是病毒載體對(duì)外源基因的最大容納量只有2500bp。目前常用的病毒載體有下列幾種。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上，病毒進(jìn)入細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進(jìn)入細(xì)胞核并整合在細(xì)胞染色體中，這種整合的病毒稱(chēng)為原病毒。在原病毒的兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）,LTR內(nèi)側(cè)還有為復(fù)制所必需的其他順序，包括包裝信號(hào)。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有CMV和SV。

DNA病毒載體 主要有腺病毒相關(guān)病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對(duì)DNA病毒載體的研究是當(dāng)前基因基因治療研究中的重點(diǎn)領(lǐng)域。

常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定的載體和導(dǎo)入方法，基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染方法有多種，根據(jù)不同的細(xì)胞，貼壁或懸浮細(xì)所可選用不同的方法，其目的是要達(dá)到設(shè)置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種，包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度、靶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)等，下面重點(diǎn)介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)：

靶細(xì)胞的準(zhǔn)備 被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長(zhǎng)狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿(mǎn)培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一將近新鮮培養(yǎng)液。對(duì)于懸浮細(xì)胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。

靶基因質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其了化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。應(yīng)用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，目前大多采用進(jìn)口的術(shù)提取純化試劑盒。

具體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，最常用的直核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立和應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是以實(shí)驗(yàn)方法交源基因?qū)胨拗魇芫鸦蛟缙谂咛ゼ?xì)胞染色體基因組內(nèi)，使其穩(wěn)定整合和遺傳給后代動(dòng)物。它主要采用顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移法與胚胎干細(xì)胞法。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，推動(dòng)了腫瘤在分子水平上的研究，它使人們認(rèn)識(shí)到激活的原癌基因的異常表達(dá)及功能失常，是腫瘤發(fā)生的初階段。將癌基因與特定細(xì)胞的調(diào)控序列連在一起，可使癌基因在特定細(xì)胞中表達(dá)，研究靶細(xì)胞對(duì)不同癌基因的易感性，闡明某一癌基因?qū)μ囟?xì)胞生長(zhǎng)、分化及功能的影響；它還可以研究多種基因的協(xié)同作用，有助于對(duì)多步驟致癌機(jī)進(jìn)行深和的探討。

轉(zhuǎn)基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，還可以通過(guò)使某一基因功能丟失（如用基因剔除技術(shù)）研究抑癌基因在腫瘤發(fā)一中的作用。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)致癌原的測(cè)試，為腫瘤的預(yù)防，治療及發(fā)現(xiàn)新的致癌物質(zhì)都提供了有價(jià)值研究工具。

基因突變的檢測(cè)方法

基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)方法也隨之迅速發(fā)展。人類(lèi)細(xì)胞癌基因的突變類(lèi)型已如上所述，對(duì)于基因突變的檢測(cè)，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對(duì)于用該法法不能檢測(cè)的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費(fèi)時(shí)的DNA序列測(cè)定分析法。

多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測(cè)技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達(dá)二十余種，自動(dòng)化程度也愈來(lái)愈高，分析時(shí)間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測(cè)方法，可根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室條件選擇時(shí)參考。

PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其堿基組成，即使一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。

用PCR-SSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突變檢出率可達(dá)70％-95％，片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50％左右，該法可能會(huì)存在1％的假陽(yáng)性率。應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類(lèi)型對(duì)檢測(cè)的靈敏度無(wú)大的影響，同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過(guò)序列分析來(lái)確定。Sarkar等認(rèn)為對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來(lái)做SSCP會(huì)提高其錄敏度。

應(yīng)用PCR-SSCP檢測(cè)點(diǎn)突變已見(jiàn)報(bào)道于人類(lèi)大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測(cè)的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測(cè)抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測(cè)第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。

異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對(duì)一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100％。

突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點(diǎn)，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點(diǎn)。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來(lái)擴(kuò)增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。

變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100％，檢測(cè)片段可達(dá)1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。

由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，需要一套專(zhuān)用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。在DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡(jiǎn)便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選。

化學(xué)切割錯(cuò)配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM為在Maxam-Gilbert測(cè)序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項(xiàng)檢測(cè)突變的技術(shù)，其檢測(cè)突變的準(zhǔn)確性可與DNA測(cè)序相仿。其基本原理為將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺或哌啶切割，錯(cuò)配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。

該法檢出率很高，也是檢片段最長(zhǎng)的方法，已有報(bào)功檢測(cè)了1.7kb片段，如果同時(shí)對(duì)正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100％。應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度，可檢測(cè)到10個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)突變細(xì)胞。該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢測(cè)法（catodiimide,CDI）,CDI為無(wú)毒物質(zhì)，也可檢測(cè)大片段DNA的點(diǎn)突變。

等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎(chǔ)對(duì)已知突變的檢測(cè)技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計(jì)一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交?？梢杂酶鞣N突變類(lèi)型的寡核苷酸探針，同時(shí)以野生型探針為對(duì)照，如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交帶，則表運(yùn)河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變，ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照避免假陽(yáng)性和假陰性。目前已有商品化的檢測(cè)盒檢測(cè)部分癌基因ASO突變。

DNA芯片技術(shù)（DNA chip） DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項(xiàng)DNA分析新技術(shù)，它集合了集成電路計(jì)算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)。可用于基因定位、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測(cè)方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個(gè)堿基，并覆蓋全部所需檢測(cè)的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過(guò)共聚集顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變，該方法快速簡(jiǎn)單、片動(dòng)化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測(cè)中心發(fā)揮非常重要的作用。

連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，其最大特點(diǎn)為可準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個(gè)基因突變，由Landegree于1988年首次應(yīng)用于鐮刀獎(jiǎng)細(xì)胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎(chǔ)，應(yīng)用兩對(duì)互補(bǔ)的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板復(fù)性，若完全互補(bǔ)，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對(duì)的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。

LCR產(chǎn)物檢測(cè)最初是通過(guò)這32p標(biāo)記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測(cè)敏感性達(dá)到200個(gè)靶分子。也可設(shè)計(jì)1個(gè)橫跨兩引物的檢測(cè)探針，用它與LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。

等位基因特異性擴(kuò)增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱(chēng)擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，吸有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

如果錯(cuò)配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱(chēng)為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)兩種或多種等位基因突變位點(diǎn)。ASA法的檢出率依賴(lài)于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時(shí)錯(cuò)配延伸，特別是當(dāng)錯(cuò)配堿基為G：T時(shí)，這時(shí)可通過(guò)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來(lái)得高瓜在特異性。在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。還可通過(guò)在引物3`端的第二個(gè)堿基引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板之間形成雙重錯(cuò)配以阻止錯(cuò)誤延伸。

RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過(guò)變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí)，RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí)，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個(gè)條鏈，突變檢出率只有30％，如同時(shí)分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于1-2kb的大片段進(jìn)行檢測(cè)，并能確定突變位點(diǎn)。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對(duì)未知突變進(jìn)行分析。

染色體原位雜交（In situ hybridization of chromosome）染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測(cè)被廣泛用于動(dòng)、植物及人類(lèi)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，隨著染色體分技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大，特別是用于腫瘤分子診斷。

腫瘤細(xì)胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類(lèi)。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)，腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細(xì)胞核型的改變。染色體的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測(cè)方法進(jìn)展很快，檢測(cè)的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。應(yīng)用核素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測(cè)到中期染色體上幾百個(gè)堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。

FISH具有探針?lè)€(wěn)定、操作安全，可快速、多色顯示多個(gè)不同探針的雜交信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)。FISH的靈敏感與探針標(biāo)記方法和檢測(cè)儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)記時(shí)摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號(hào)強(qiáng)度。FISH探針一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到0.25kb。

應(yīng)用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強(qiáng)信噪比，有利于檢測(cè)微弱信號(hào)，如應(yīng)用TSA系統(tǒng)（tyramide signal amplification）能將雜交信號(hào)再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來(lái)，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達(dá)1-2kb。還可采用對(duì)分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖（microdissect）法以提高分辨率。

FISH的另一個(gè)特點(diǎn)是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng)， 在一次雜交中可檢測(cè)多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、易位重排及缺失等的檢測(cè)，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。

Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色體特異α衛(wèi)星DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當(dāng)引物延伸時(shí)，摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點(diǎn)。

PRINS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需克隆基因作探針，且由于雜交反應(yīng)在前，標(biāo)記在后，故非特異懷背景低。缺點(diǎn)是信號(hào)弱，靈敏度低，為克服這一制瞇，Terkelsen等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)（repeated PRINS）,重復(fù)進(jìn)行PRINS反應(yīng)，使信號(hào)號(hào)強(qiáng)度明顯提高。基于FISH的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記（multicolor PRINS）,可測(cè)定二個(gè)以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特異性比FISH還高。

DNA序列分析（DNA sequencing） 應(yīng)用各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類(lèi)型及突變位置，其效率可以達(dá)到100％。現(xiàn)在的測(cè)序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動(dòng)化程度大為提高，操作更簡(jiǎn)便，測(cè)序時(shí)間也大大縮短。隨著PCR技術(shù)與測(cè)序聯(lián)合使用，不需經(jīng)過(guò)M13亞克隆步驟，故稱(chēng)為直接測(cè)序法（direct sequencing,DS）。

DS法測(cè)序的模板主主要來(lái)源于PCR，應(yīng)用不對(duì)稱(chēng)PCR（asymmetric PCR）和基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來(lái)，PCR循環(huán)測(cè)序法的建立，使模板擴(kuò)增與同步進(jìn)行，引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記，使每個(gè)樣品的四個(gè)測(cè)序反應(yīng)可在一個(gè)反應(yīng)管和一個(gè)泳道內(nèi)進(jìn)行，大大提高了測(cè)鄧的自動(dòng)化程度。目前PE公司推同出的DNA自動(dòng)測(cè)序儀已發(fā)展到96泳道，并仍在不斷改進(jìn)。這些高度自動(dòng)化的測(cè)序方法是經(jīng)較理想的基因突變分析技術(shù)，但其昂貴的費(fèi)用其使用范圍，所以對(duì)一些小樣本或?yàn)榱四承┨囟康牡臉颖痉治?，仍進(jìn)行經(jīng)典的手工測(cè)序。

突變基因的檢測(cè)方法多種多樣，特別是PCR技術(shù)誕生后，許多檢測(cè)技術(shù)都是在PCR基礎(chǔ)上衍生的。由于PCR擴(kuò)增南非要的模板量少，使對(duì)腫瘤的突變分析可以精確到單細(xì)胞，如霍奇金病的R-S細(xì)胞的單細(xì)胞基因突變分析。

另外，應(yīng)用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測(cè)的靶點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是可克服腫瘤組只中間質(zhì)或癌周組織的混雜，提高準(zhǔn)確性。除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測(cè)，如對(duì)未知突變基因進(jìn)行分析的酶促切割錯(cuò)配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法（protein truncation test,PTT）等。對(duì)已知突變基因進(jìn)行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測(cè)法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法

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